Mikropsuz eşekarısı yetiştirme prosedürünün optimize edilmesi

Özet

Nasonya yaban arısı embriyoları, 12-24 saat boyunca parazitizasyondan sonra Lucillia sericata pupalarından diseke edildi ve mikropsuz embriyolar elde etmek için alkol ve% 10 sodyum hipoklorit çözeltisi ile yıkandı. Mikropsuz embriyoları yetiştirdikten ve in vitro olarak büyümek ve gelişmek için onlara Nasonya yetiştirme ortamı sağladıktan sonra, mikropsuz Nasonia yetişkinleri elde edildi.

Özet

Aseptik yetiştirme teknolojisi, dış mikroorganizmaların böcek mikrobiyotası üzerindeki etkisini etkili bir şekilde ortadan kaldırabilen ve böylece böcek mikrobiyota araştırmalarının hızlı gelişimini teşvik edebilen steril veya neredeyse steril koşullar altında böceklerin kültürlenmesi için bir yöntemdir. Nasonia (yaban arısı cinsi), kısa ömürlü, yüksek genetik çeşitlilik, kolay kullanım vb. gibi birçok avantajı olan ve böcek model sistemi olarak yaygın olarak kullanılan parazitik bir yaban arısı böceğidir. Sadece hayvanlardaki mikroorganizma sayısını azaltabilen antibiyotik tedavisinin aksine, aseptik yetiştirme teknikleri, hayvanlardaki mikroorganizmaların hem bileşimini hem de miktarını kontrol edebilir ve konakçı-mikrop etkileşimlerinin incelenmesini daha da kolaylaştırabilir. Bununla birlikte, Nasonya yetiştirme ortamının (NRM) önceki sürümleri, karmaşık ve zaman alıcı bir hazırlama süreci, bakteri veya mantarlar tarafından kolay kontaminasyon ve kısa depolama süresi gibi bazı kusurlara ve sorunlara sahiptir. Bu nedenle, bu çalışma NRM hazırlama sürecinde kullanılan araçları, depolama koşullarını ve bileşen oranlarını optimize ederek bu sorunları çözmektedir. Optimize edilmiş ortam, en az 3 ay boyunca -20 ° C'de depolamaya izin verebilir ve steril eşekarısı beslemesi sırasında NRM kontaminasyonu olasılığını ortadan kaldırabilir. Bu, Nasonya'yı mikrobiyal araştırmalar için bir model olarak kullanmak için önemli olan aseptik Nasonya'nın hayatta kalma oranını ve sağlık seviyesini daha da artırır.

Giriş

Mikropsuz hayvanlar, tespit edilebilir canlı mikroorganizmalara ve parazitlere sahip olmayan hayvanlardır¹. Mikropsuz embriyolar, annenin aseptik koşullar altında diseke edilmesi ve daha sonra bariyer sistemlerde yetiştirilmesi ile elde edilebilir². Bu tür hayvanlar, mikroorganizmaların bağırsak mikrobiyotası, bağışıklık sistemi ve metabolizma 1 gibi hayvanlar üzerindeki etkilerini incelemek için^{kullanılabilir.} Bazı teknik araçlarla, birçok böcek ve hatta memeliler steril hale getirilebilir ^3,4. Mikropsuz hayvanlar benzersiz bir role sahiptir ve mikrobiyoloji araştırmalarının çeşitli yönlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır⁵. Örneğin, mikropsuz Nasonia yaban arılarının kullanımı, mikroorganizmaların konakçıların uzun süreli eksojen çevresel stres altında yeni ortamlara uyum sağlamasına yardımcı olabileceğini ortaya koymuştur ^6,7.

Nasonia parazitoidleri, yumurtalarını sineklerin pupalarına enjekte eden küçük parazitik eşekarısıdır⁴. Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti ve Nasonia oneida ⁸ dahil olmak üzere bilinen dört Nasonia türü vardır. N. vitripennis dünya çapında bulunabilirken, diğer üç türün Kuzey Amerika'da sınırlı aralıkları vardır⁴. Nasonya parazitoid eşekarısı, kolay ekim, kısa üreme döngüsü, dizilenmiş genom ve uzun süreli diapause ^8,9 gibi özellikleri nedeniyle ideal model böcekler olarak kabul edilir. Böcek evrimi, genetik, gelişim, davranış ve simbiyoz^10'un çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirler. Ayrıca, Nasonia parazitoid eşekarısı da tarım ve hastalık^11'de zararlı sineklerin kontrolüne yardımcı olabilir. Steril bir böcek sisteminin başarılı bir şekilde kurulması iki ana adımı içerir: (1) embriyoların sterilizasyonu ve (2) larvalara in vitro steril gıda sağlanması. Steril gıda elde etmek için Brucker ve Bordenstein 12, bakterileri öldürmek için antibiyotik, ağartıcı ve fetal sığır serumu gibi kimyasallar kullanarak 2012 yılında Nasonya yetiştirme ortamını (NRMv1) geliştirdi¹². Bununla birlikte, kimyasal sterilizasyon yöntemi, N. vitripennis^13'ün düşük sağkalım ve eklosyon oranlarına neden olmuştur. Daha sonra, 2016 yılında, Shropshire ve ark., antibiyotiklerin ve diğer maddelerin tehlikelerini ortadan kaldırmak için kimyasal sterilizasyon yöntemi yerine bir filtre sterilizasyon yöntemi kullanarak NRMv2'yi geliştirdi ve üreme sürecini optimize etti¹³. Ne yazık ki, bu yöntemin hala ortamın hazırlanması ve kullanılmasıyla ilgili zorlukların yanı sıra embriyolar, larvalar ve kapalı pupalar için boğulma, yetersiz beslenme veya dehidrasyon riskleri gibi bazı dezavantajları vardır¹⁴. Wang ve Brucker¹⁴ yakın zamanda Nasonia yetiştirme ortamı sürüm 3 (NRMv3) ve mikropsuz yetiştirme sürüm 2 (GFRv2) protokollerini geliştirdi. Bu iyileştirmeler maliyeti ve medya tüketimini azalttı. Bununla birlikte, NRMv3 çok kısa bir depolama süresine sahiptir ve kontaminasyona karşı oldukça hassastır.

NRMv3 üzerine inşa edilen NRM hazırlama aracı depolama yöntemi ve besin oranı bu çalışmada optimize edilmiştir. Bu metodolojik arıtma, N. vitripennis'in mikrobiyom çalışmaları için bir model olarak kullanılmasını kolaylaştırır. Wang ve ark.14 tarafından geliştirilen NRMv3 ile karşılaştırıldığında, NRM hammaddelerinden biri olan Sarcophaga bullata pupa'yı sıkmak için geliştirilmiş araç, Wang ve ^ark.14 tarafından kullanılan bir alt deliğe sahip 60 mL şırıngaya kıyasla S. bullata pupa doku sıvısının üretim verimliliğini büyük ölçüde artırmaktadır. NRM'nin besin oranını ayarladık, bu da mikropsuz Nasonya eşekarısının hayatta kalma oranında, gelişim sürelerini etkilemeden belirli bir artışa yol açtı. Ek olarak, NRM küçük kapasiteli santrifüj tüplerine (1,5 mL) paketlendi ve depolama süresini uzatmak için -20 ° C'lik bir buzdolabında donduruldu. Ev sineği Lucilia sericata'yı NRM hazırlığı için konakçı ve kaynak olarak kullanırken, bu protokolün laboratuvarda bulunan diğer Nasonia konakçıları için uyarlanabileceğini belirtmek gerekir.

Protokol

1. Mikropsuz Nasonia yetiştirme ortamının hazırlanması

1. Piyasada satılan L. sericata pupalarını (bkz. Malzeme Tablosu) tepsi veya kağıt gibi tüm pupaları barındırabilecek bir yüzeye yerleştirin. Az gelişmiş larvaları, koyu yaşlı pupaları, boş pupa kabuklarını, talaşları veya diğer safsızlıkları atın. Sadece kahverengimsi-kırmızı renkli genç pupaları saklayın ve bunları bir behere (yaklaşık 3.000-4.000 pupa) aktarın.
   NOT: Birçok deney yapıldıktan sonra, karanlık eski pupalardan yapılan ortamın kolayca karardığı ve mikropsuz eşekarısı gelişimini durdurduğu bulunmuştur. Bu fenomen, genç kahverengimsi-kırmızı pupaları orta üretmek için kullanırken ortaya çıkmadı. Bunun nedeni hala belirsizdir ve doğrulamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
2. Pupaların tüm yüzeyini kaplayacak kadar behere yeterli miktarda deiyonize su ekleyin. Beherin ağzını infoil veya gazlı bezle sarın, pupaların yüzeyindeki safsızlıkları temizlemek için beheri sallayın ve ardından suyu dökün. Üç ila beş kez tekrarlayın.
3. Temizlenmiş L. sericata pupalarını bir sarımsak presinin filtre tankına yerleştirin, sert sıkın ve L. sericata pupalarının doku sıvısını 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpünde toplayın . Ardından, pupa pisliklerini dökün ve hepsi sıkılana kadar sarımsak presinin filtre tankına yeni pupa koyun.
   NOT: Wang ve ^ark.14 tarafından kullanılan iğne ekstrüzyon cihazına kıyasla, sarımsak presi daha uygundur ve interstisyel sıvıyı daha iyi ayırabilir. Bu ilerleme, NRM'nin büyük ölçekli üretimi ve uzun süreli depolanması için temel oluşturmaktadır.
4. Karışımı 4 °C'de (25.000 x g) 10 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, karışım aşağıdan yukarıya doğru üç katmana ayrılacaktır: tortu tabakası, protein tabakası ve yağ tabakası (Şekil 1).
5. Filtrasyon sırasında tıkanmayı önlemek için, protein tabakasını 18 G steril bir iğne kullanarak aspire edin ve yeni bir 50 mL konik steril polipropilen santrifüj tüpüne aktarın.
6. Protein ekstraktına 1: 1 oranında ticari sıvı Drosophila ortamı (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
   NOT: NRMv3 ile karşılaştırıldığında, konakçı ve NRM hammaddesi olarak daha uygun ticarileştirilmiş L. sericata kullanılmıştır. Bu nedenle, beslenme oranı, steril Nasonya'nın büyümesi ve gelişmesi için daha uygun olan NRMv3'e dayanarak 1: 2'den 1: 1'e ayarlandı (Şekil 2).
7. Farklı boyutlardaki parçacıkları gidermek için karışık ortamı (Drosophila ortamı ve L. sericata pupa'nın protein özü), farklı gözenek boyutlarına (8, 1.2, 0.8 ve 0.45 μm; bkz. Malzeme Tablosu) sahip bir vakum filtreleme sistemi kullanarak filtreleyin. Tıkanmayı önlemek için, akış yavaşladığında filtre kağıdını değiştirin.
   NOT: Her filtreleme için yeni bir 50 mL steril santrifüj tüpünün kullanılması gerekmektedir.
8. Sıvıyı 10 dakika boyunca 4 ° C'de (15.000 x g) tekrar santrifüj edin ve süpernatant ortamı 0,22 μm şırınga filtresiyle sterilize edin. Yukarıdaki adımları bir kez tekrarlayın.
9. Uzun süreli depolama için ayırma işleminden sonra kültür ortamını -20 ° C'de saklayın (Şekil 3A).
   NOT: Kontaminasyonu ve tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için, ambalajlamadan sonra kültür ortamını kullanırken NRM'nin her bir tüpünün sadece bir kez açılması önerilir (Şekil 3A).

2. Mikropsuz yumurta toplama

1. Yavrularda istikrarlı bir erkek-dişi oranı sağlamak için, pupaları pupa evresi sırasında haploid genetik özelliklerinden dolayı 50 dişi ila 15 erkek oranında bir Drosophila şişesine yerleştirin (erkekler haploid hücrelerden gelişirken, dişiler döllenmiş yumurtalardan kaynaklanan diploid hücrelerden gelişir)^4,15.
   1. Yetişkinlere çıktıktan sonra, erkeklerin ve dişilerin 1,5 gün boyunca çiftleşmesine izin verin ve ardından şişeye yaklaşık 40 L. sericata pupa koyun. Parazitleşmeden sonraki 12-24 saat içinde, pupa kabuğunun bir ucunu stereomikroskop altında dikkatlice açmak için steril bir diseksiyon iğnesi kullanın (Şekil 4).
   2. Diğer ucunu elle tutun ve yaban arısı embriyolarını bulun. Embriyoları L. sericata pupa dokusunun yüzeyinden fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril bir hücre süzgecine aktarmak için diseksiyon iğnesi ^kullanın14.
      NOT: Parazitizm için eski L. sericata pupa kullanılmalıdır, çünkü kuru L. sericata pupa dokusunun embriyoları transfer etmesi daha kolaydır. Yumurtaların L. sericata pupa doku yüzeyinden düzgün bir şekilde aktarılmasını sağlamak için, diseksiyon iğnesi pupa vakasını açtığında dokuyu delmemeye dikkat edin, böylece interstisyel sıvı dışarı akmaz.
2. Bir hücre süzgeci üzerine 20-30 embriyo yerleştirin ve bunları 1.000 μL% 10 ticari sodyum hipoklorit çözeltisi ile eşit şekilde yıkayın (bakınız Malzeme Tablosu), ardından 1.000 μL 1x steril PBS ile başka bir yıkama yapın. Daha sonra, 1.000 μL% 70 etanol çözeltisi ile bir kez yıkayın ve 1.000 μL 1x steril PBS ile üç kez yıkayın.
3. İlk olarak, 1x PBS ile önceden ıslatılmış 5 mm çapında bir polipropilen örgü levhayı (bkz. Malzeme Tablosu) 24 delikli bir plakaya yerleştirin. Daha sonra, sterilize edilmiş küçük bir fırça kullanarak, hücre süzgeci üzerindeki yaban arısı embriyolarını polipropilen ağ tabakasına nazikçe fırçalayın. Bu, 24 delikli plakanın dikey bir sütunundaki dört kuyucuk için de yapılabilir.

3. Mikropsuz yaban arısı yetiştiriciliği

1. Laminer akış davlumbazındaki her bir kuyucuğa 50 μL NRM ekleyin. Büyüme için nemli bir ortam sağlamak için, 24 delikli plakadaki her bir kuyucuk arasına 1 mL steril su ekleyin. 30 mL steril su içeren küçük bir beher, 24 delikli plakaya sahip 5 L steril plastik kutuya da yerleştirilebilir.
   1. Tüm deney boyunca, steril plastik kutuyu ve 24 delikli plakayı bir iklim odasında 25 ± 2 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta ve sabit ışık altında tutun.
2. NRM'yi her gün aktarmadan ve eklemeden önce, dondurulmuş NRM'yi laminer bir akış tezgahında çözün. Steril bir ortamda, üzerinde larva bulunan polipropilen ağı bir kuyudan diğerine aktarmak için alkolle dezenfekte edilmiş cımbız kullanın. Son olarak, oda sıcaklığına dengelenmiş 50 μL NRM ekleyin (Şekil 3B). Pupalar gözlenene kadar yukarıdaki işlemleri her gün tekrarlayın.
   NOT: Eşekarısı gelişimi ile, mikropsuz eşekarısı yeterli beslenmeye sahip olmasını sağlamak için NRM miktarı uygun şekilde arttırılmalıdır. Örneğin, dördüncü instar larvalarına 60 ila 70 μL NRM verildi. Farklı gelişim aşamaları aynı kuyuda bir arada bulunabileceğinden, pupaları dışarı aktarmak için sterilize edilmiş bir fırça kullanın. Kalan larvalara az miktarda NRM ekleyin. Mikrobiyal istila ve kirliliği önlemek için aseptik teknikler kullanın.
3. 9 ila 11 gün beslendikten sonra larvaların% 80'inden fazlası beyaz veya sarı pupaya dönüşür. Şu anda, filtreyi temiz bir kuyu plakasına taşıyın ve eklosyonu beklemek için kültür ortamı eklemeyi bırakın.

Sonuçlar

NRM'nin hazırlık verimliliği, hazırlık araçları geliştirilerek büyük ölçüde iyileştirildi. Ek olarak, besleme sürecindeki NRM kirliliği sorunu, strateji ve koruma yöntemi optimize edilerek ortadan kaldırılmıştır. Aynı zamanda, ayarlanmış NRM, konakçı olarak L. sericata ile mikropsuz eşekarısının büyümesi ve gelişmesi için daha uygun bir beslenme oranına sahipti. Larvalardan pupalara kadar mikropsuz eşekarısının hayatta kalma oranı, GFRv3 kullanılarak NRMv2 ile yetiştiri...

Tartışmalar

Genomik ve metabolomik gibi yüksek verimli tespit teknolojilerinin uygulanmasıyla, araştırmacılar yavaş yavaş bağırsak mikrobiyotasında büyük genetik çeşitlilik ve metabolik karmaşıklık olduğunu fark ettiler¹⁶. Bu simbiyotik bakteriler, konakçı beslenme metabolizması, tümörler, bağışıklık ve konakçı ile karmaşık etkileşimler yoluyla yaşlanma gibi çeşitli fizyolojik veya patolojik durumlarla yakından ilişkilidir¹⁷. Bununla birlikte, kona...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56