JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, akış sitometrisi için porfirin bazlı kompanzasyon boncuklarının, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncukların porfirin TCPP ve amid kuplajlı reaktif EDC ile reaksiyonu ile nasıl hazırlandığını açıklar. Partikül yan ürünlerini azaltmak için bir filtreleme prosedürü kullanılır.

Özet

Akış sitometrisi, floresan ölçümlerine dayanarak çeşitli hücre popülasyonlarını hızla karakterize edebilir ve ölçebilir. Hücreler ilk önce bir veya daha fazla floresan reaktifi ile boyanır, her biri hücre yüzeyi antijen ekspresyonu gibi fenotipik özelliklerine göre hücrelere seçici olarak bağlanan farklı bir floresan molekülü (florofor) ile işlevselleştirilir. Hücrelere bağlı her reaktiften floresan yoğunluğu, belirli bir dalga boyu aralığını tespit eden kanallar kullanılarak akış sitometresinde ölçülebilir. Birden fazla florofor kullanıldığında, bireysel floroforlardan gelen ışık genellikle istenmeyen algılama kanallarına dökülür ve bu da kompanzasyon adı verilen bir işlemde floresan yoğunluğu verilerinde bir düzeltme gerektirir.

Kompanzasyon kontrol parçacıkları, tipik olarak tek bir florofora bağlı polimer boncuklar, bir hücre etiketleme deneyinde kullanılan her florofor için gereklidir. Akış sitometresinden gelen kompanzasyon parçacıklarından elde edilen veriler, floresan yoğunluğu ölçümlerine bir düzeltme uygulamak için kullanılır. Bu protokol, floresan reaktif mezo-tetra (4-karboksifenil) porfin (TCPP) ile kovalent olarak işlevselleştirilmiş polistiren kompanzasyon boncuklarının hazırlanması ve saflaştırılmasını ve bunların akış sitometri kompanzasyonunda uygulanmasını açıklamaktadır. Bu çalışmada, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuklar, pH 6'da ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca ajitasyon ile TCPP ve amid kuplajlı reaktif EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodiimid hidroklorür) ile muamele edilmiştir. TCPP boncukları santrifüjleme ile izole edildi ve depolama için bir pH 7 tamponunda yeniden askıya alındı. TCPP ile ilişkili partiküller bir yan ürün olarak gözlendi. Bu partiküllerin sayısı, isteğe bağlı bir filtreleme protokolü kullanılarak azaltılabilir. Elde edilen TCPP boncukları, çoklu floroforlarla etiketlenmiş insan balgam hücreleri ile yapılan deneylerde telafi için bir akış sitometresinde başarıyla kullanıldı. TCPP boncukları, 300 gün boyunca buzdolabında saklandıktan sonra stabil olduğunu kanıtladı.

Giriş

Porfirinler, floresan ve tümör hedefleme özellikleri nedeniyle biyomedikal alanda uzun yıllardır ilgi görmektedir 1,2,3. Fotodinamik terapi (PDT) ve sonodinamik terapi (SDT) gibi terapötik uygulamalar, bir kanser hastasına sistematik olarak porfirin uygulanmasını, ilacın tümörde birikmesini ve tümörün belirli bir dalga boyundaki veya ultrasonun lazer ışığına lokalize maruz kalmasını gerektirir. Lazer ışığına veya ultrasona maruz kalmak, porfirin tarafından reaktif oksijen türlerinin üretilmesine ve ardından hücre ölümüne yol açar 4,5. Fotodinamik tanıda (PDD), kanser hücrelerini normal hücrelerden ayırmak için porfirin floresan kullanılır6. Bu bağlamda, öncülü 5-aminolevülinik asidin (5-ALA) sistemik veya lokal enjeksiyonu üzerine tümörlerde biriken doğal bir floresan porfirin olan protoporfirin IX, gastrointestinal stromal tümörleri, mesane kanserini ve beyin kanserini tanımlamak için kullanılır 7,8. Daha yakın zamanlarda, 5-ALA tedavisi, multipl miyelom9'da minimal rezidüel hastalığı tespit etmek için bir yaklaşım olarak araştırılmıştır. Laboratuvarımız tetraaril porfirin TCPP'yi (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksifenil)-21,23 H-porfin) insan balgam örneklerinde akciğer kanseri hücrelerini ve kanserle ilişkili hücreleri seçici olarak boyama kabiliyeti için kullanmaktadır ve bu özellik slayt tabanlı ve akış sitometrik tanı tahlillerinde kullanılmaktadır10.

Bazı porfirinler, terapötik ve tanısal ajanlar olarak kullanılabilmeleri açısından iki işlevlidir 2,11. Biyomedikal araştırmalarda, bu tür iki işlevli porfirinler, kanser hücrelerini seçici olarak hedefleme ve öldürme yeteneklerinin yapılarının bir fonksiyonu olduğunu ve diğer bileşiklerin varlığından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için kullanılır 12,13,14,15,16. Porfirinlerin hem hücresel alımı hem de sitotoksisitesi, bir akış sitometrik platformunda yüksek verimli bir şekilde ölçülebilir. Floresan porfirinlerin absorpsiyon ve emisyon spektrumları karmaşıktır, ancak çoğu akış sitometrik platformu bunları doğru bir şekilde tanımlamak için donatılmıştır. Floresan porfirinlerin absorpsiyon spektrumu, Soret bandı olarak bilinen 380-500 nm aralığında güçlü bir absorpsiyon bandı ile karakterize edilir. İki ila dört zayıf absorpsiyon bandı genellikle 500-750 nm aralığında (Q bantları) gözlenir17. Çoğu akış sitometresinde bulunan mavi bir 488 nm lazer veya bir mor lazer (405 nm), porfirinleri uyarmak için uygun dalga boyunda ışık üretebilir. Porfirinlerin emisyon spektrumları tipik olarak 600-800 nm aralığında pikler gösterir18, bu da floresein izotiyosiyanat veya fikoeritrin (PE) floroforlarla çok az spektral örtüşme ile sonuçlanır, ancak allophycocyanin (APC) gibi diğer sık kullanılan floroforların yanı sıra PE-Cy5 ve diğerleri gibi tandem floroforlarla önemli ölçüde örtüşür. Bu nedenle, çok renkli akış sitometri tahlillerinde porfirinler kullanıldığında, porfirinin floresansını ölçmek için belirlenenden başka kanallarda floresan yayılımını yeterince düzeltmek için tek florofor kontrolleri gereklidir.

İdeal olarak, bir florofor paneli için yayılma matrisini hesaplamak için kullanılan tek florofor kontrolleri ("kompanzasyon kontrolleri" olarak da adlandırılır), numune ile aynı hücre tiplerinden oluşmalıdır. Bununla birlikte, numunenin bu amaçla kullanılması, başlamak için çok az örnek varsa veya numune içindeki hedef popülasyon çok küçükse (örneğin, hastalığın erken evrelerinde minimal kalıntı hastalığa veya kanser hücrelerine bakmak istiyorsa) optimal değildir. Hücrelere yararlı bir alternatif, numuneyi analiz etmek için kullanılan aynı florofor ile birleştirilmiş boncuklardır. Bu tür boncukların çoğu ticari olarak temin edilebilir; Bu boncuklar ya istenen florofor (önceden etiketlenmiş florofora özgü boncuklar)19,20 ile önceden etiketlenir ya da floresan olarak etiketlenmiş bir antikor bunlara bağlanabilir (antikor yakalama boncukları)20,21. Birçok florofor için ticari tazminat boncukları mevcut olsa da, bu tür boncuklar temel ve klinik araştırmalarda artan kullanımlarına rağmen porfirinler için mevcut değildir.

Numune koruma ve uygun büyüklükte pozitif ve negatif popülasyonlara ek olarak, boncukları kompanzasyon kontrolleri olarak kullanmanın diğer avantajları hazırlık kolaylığı, düşük arka plan floresansı ve zaman içinde mükemmel stabilitedir22. Boncukların bir kompanzasyon kontrolü olarak kullanılmasının potansiyel dezavantajı, boncuklar üzerinde yakalanan floresan antikorun emisyon spektrumunun, hücreleri etiketlemek için kullanılan aynı antikorunkinden farklı olabileceğidir. Bu, spektral akış sitometresi20 kullanıldığında özel bir öneme sahip olabilir. Bu nedenle, boncukların bir kompanzasyon kontrolü olarak geliştirilmesi, boncukların geliştirildiği tahlil için kullanılacak akış sitometresinde yapılmalıdır. Ayrıca, boncukların gelişimi, aynı floresan boyama reaktifi ile etiketlenmiş hücrelerle bir karşılaştırma içermelidir.

Burada, algılama kanalındaki medyan floresan yoğunluğu balgamdaki TCPP etiketli hücrelerinkiyle karşılaştırılabilir olan TCPP amin işlevli polistiren kompanzasyon boncuklarının hazırlanmasını ve akış sitometrisi için kompanzasyon kontrolleri olarak kullanımlarını açıklıyoruz. Eşdeğer, işlevsel olmayan boncukların otofloresansı, negatif floresan kompanzasyon kontrolleri olarak kullanımları için yeterince düşüktü. Ek olarak, bu boncuklar yaklaşık 1 yıl boyunca depolamada stabilite gösterdi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm prosedürler uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak yapılmalıdır.

1. TCPP stok çözeltisinin hazırlanması, 1.0 mg / mL

NOT: Bu aylık olarak hazırlanabilir.

  1. Analitik terazi, spatula ve tartım kağıdı kullanılarak 49,0-50,9 mg TCPP ağırlığındadır. Ağırlığı miligramın 1 / 10'una yuvarlayın. Ölçülen TCPP miktarını ışıktan korumalı olarak bir kenara koyun.
    NOT: Ağırlık okuması kararsızsa statik bir tabanca kullanın.
  2. Adım 1.1'de tartılan TCPP miktarına bağlı olarak Tablo 1'den gerekli arıtılmış su ve izopropanol (IPA) miktarlarını belirleyin. Arıtılmış suyu ve izopropanol'ü 100 mL'lik bir cam behere ekleyin ve buharlaşmadan korumak için parafilmle örtün.
  3. Adım 1.1'de tartılan TCPP miktarına bağlı olarak Tablo 1'den gerekli sodyum bikarbonat miktarını belirleyin.
  4. Analitik teraziyi, spatulayı ve tartım kağıdını kullanarak adım 1.3'te belirlenen gerekli sodyum bikarbonat miktarını tartın. Ağırlığı miligramın 1 / 10'una yuvarlayın.
    NOT: Ağırlık okuması kararsızsa statik bir tabanca kullanın.
  5. Sodyum bikarbonatı arıtılmış su ve izopropanol içeren 100 mL beher içine ekleyin. Buharlaşmadan korumak için çözeltiyi parafilmle örtün.
  6. Adım 1.5'teki çözeltiyi bir karıştırma plakasına yerleştirin ve eriyene kadar karıştırın (yaklaşık 10 dakika)
  7. Adım 1.6'daki sodyum bikarbonat içeren çözeltinin 9 ila 10 arasında bir pH'a sahip olduğundan emin olmak için pH'ı ölçün.
  8. Adım 1.1'de tartılan TCPP'yi adım 1.7'den itibaren çözeltiye yavaşça ekleyin ve çözünene kadar karıştırmaya devam edin (~ 30 dakika). Bu adımda ışıktan koruyun.
  9. Oda sıcaklığında bir cam veya polipropilen kapta saklayın ve ışıktan koruyun.

2. 2-(N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) ve hemisodyum tuzu tampon çözeltisi, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("MES tamponu") hazırlanması

NOT: Kullanım günü hazırlanmalı ve oda sıcaklığında tutulmalıdır.

  1. 2.50 g MES hemisodyum tuzunu tartın ve bunu 150 mL'lik plastik bir şişeye ekleyin.
  2. 121 mL arıtılmış su ekleyin ve katı görünmeyene kadar manuel çalkalama ile çözün.
  3. MES tamponunun pH'ını 6 ile 6,2 arasında olduğundan emin olmak için ölçün.
  4. Aynı gün kullanmak üzere oda sıcaklığında muhafaza edin.

3. N-(3-Dimetilamininopropil)-N'-etilkarbodiimid (EDC) tozu

  1. EDC tozunu dondurucudan çıkarın ve 5. adımda kullanana kadar oda sıcaklığında bekletin.

4. Amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncukların TCPP çözeltisi ile birleştirilmesi

  1. Adım 2'de hazırlanan 0,1 M MES tampon çözeltisinden 4,3 mL'sini 15 mL'lik bir polipropilen tüpe ekleyin.
  2. Amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuk süspansiyonunu (10 μm, %2,5 w/v) maksimum hızda 60 sn boyunca vorteks.
  3. Bu yeni girdaplı boncuk süspansiyonundan 288 μL'sini adım 4.1'den itibaren MES tamponuna ekleyin.
  4. MES/boncuk çözeltisini maksimum hızda 15 sn boyunca vorteks.
  5. Vorteks 1. adımda hazırlanan 1 mg/mL TCPP çözeltisini maksimum hızda 60 s boyunca yapın.
  6. Bu yeni girdaplı TCPP stok çözümünden 1,20 mL'sini adım 4.4'ten itibaren MES/boncuk süspansiyonuna ekleyin.
  7. MES / boncuk / TCPP süspansiyonunu maksimum hızda 15 s boyunca vorteks.
  8. EDC çözeltisi hazırlanırken tüpü folyo ile örtün.

5. N-(3-dimetilamininopropil)-N'-etilkarbodiimid (EDC) hidrokolorid (HCl) stok çözeltisinin hazırlanması

NOT: EDC çözeltisi bozulabilir ve hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır.

  1. Yeni bir 50 mL konik tüpe 20,0 mL arıtılmış su ekleyin.
  2. 3. adımdan itibaren 200 mg EDC HCl'yi tartın ve suya ekleyin (adım 5.1).
  3. Net bir çözüm üretmek için EDC HCL'yi maksimum hızda 15 sn boyunca vorteks.

6. EDC HCl/MES çalışma solüsyonunun hazırlanması

NOT: EDC HCl/MES çözeltisi bozulabilir özelliktedir ve hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır.

  1. 150 mL'lik plastik bir şişeye 54,0 mL MES tampon çözeltisi (adım 2'de hazırlanan) ekleyin.
  2. MES tampon çözeltisine 6,0 mL EDC HCl stok çözeltisi (5. adımda hazırlanan) ekleyin ve 10 sn çalkalayarak karıştırın.

7. Boncukların TCPP ile etiketlenmesi

  1. MES tamponundaki boncukları ve TCPP'yi içeren 15 mL polipropilen tüpe 4,5 mL EDC çalışma çözeltisi (adım 6'dan itibaren) ekleyin (adım 4.7).
  2. Tüpü oda sıcaklığında 16 saat boyunca 35 rpm'de bir ters çevirici rotatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun.
  3. Tüpü oda sıcaklığında 1.000 × g'da 10 dakika santrifüj edin.
  4. Süpernatanı aspire edin ve boncukları 0.8 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) yeniden askıya alın.
  5. Boncuk çözeltisini 1 mL pipet ile kehribar renkli bir polipropilen şişeye aktarın ve bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Boncuklar bu noktada en az 3 ay boyunca stabildir.

8. TCPP boncuklarının akış sitometrisi ile kalite kontrolü (QC)

NOT: QC, TCPP boncuklarının medyan floresan yoğunluğunun (MFI) kullanım amaçları için yeterince parlak olup olmadığına ve prosedür tarafından üretilen partikül miktarına odaklanmalıdır. Daha fazla ayrıntı için temsili sonuçlar bölümüne bakın.

  1. Bir adet 5 mL polistiren tüpü "TCPP negatif boncuklar" olarak etiketleyin.
    NOT: Negatif boncuklar, etiketleme için kullanılan amin fonksiyonelleştirilmiş boncuklardan farklıdır. Malzeme tablosuna bakın.
  2. Başka bir tüpü "TCPP pozitif boncuklar" olarak etiketleyin.
  3. Başka bir tüpü "Gökkuşağı boncukları" olarak etiketleyin.
  4. Aliquot 300 μL buz gibi HBSS, "TCPP negatif boncuklar" ve "TCPP pozitif boncuklar" ile etiketlenmiş tüplere yerleştirilmiştir.
  5. "Gökkuşağı boncukları" olarak etiketlenmiş tüpe 500 μL buz gibi HBSS ekleyin.
  6. İşlevsel olmayan polistiren (etiketsiz) boncuk süspansiyonunu maksimum hızda (2-3 s) kısaca vorteks edin ve "TCPP negatif boncuklar" etiketli tüpe 10 μL ekleyin.
  7. TCPP etiketli boncuk süspansiyonunu (adım 7.5'te sonlandırılmış) kısaca maksimum hızda vorteks edin ve "TCPP pozitif boncuklar" tüpüne 3 μL ekleyin.
  8. Gökkuşağı boncuk süspansiyonunu maksimum hızda kısaca vorteksleyin ve "Gökkuşağı boncukları" tüpüne iki damla ekleyin.
  9. Tüm tüpleri buz üzerinde, kapalı ve ışıktan koruyun.
  10. Akış sitometresinin uygun günlük başlatma prosedürlerini başlatın ve optimum sıvıları ve lazer hizalamasını doğrulamak için bir QC gerçekleştirin.
    NOT: Protokolün bu bölümünde, operatörün, ışık saçılımını ve floresan yoğunluğunu standartlaştırma prosedürlerinin yanı sıra doğru kompanzasyon matrisini hesaplamanın temel prensipleri de dahil olmak üzere mevcut akış sitometresinin kullanımı konusunda eğitildiği varsayılmaktadır.
  11. Farklı koşular arasında voltaj ayarlarını değiştirmeden Rainbow boncuklarını ve TCPP boncuklarını çalıştırın.
    1. Koş ve Gökkuşağı boncuklarının 10.000 etkinliğini topla.
    2. Su ile durulayın ve TCPP negatif boncukların 10.000 olayını toplayın.
    3. Su ile durulayın ve TCPP pozitif boncukların 10.000 olayını toplayın.
    4. 1 dakika suyla durulama yapın.
      NOT: TCPP boncuklarını çalıştırdıktan sonra su ile durulama yapmak önemlidir. TCPP sitometredeki çizgilerden durulanmazsa, artık TCPP'nin elde edilecek bir sonraki tüpteki hücreleri etiketleyebilme olasılığı vardır.
    5. Sitometre için üreticinin talimatlarına özgü uygun temizleme ve kapatma protokollerini uygulayın.
      NOT: Temsili sonuçlar için bkz: Şekil 1.

9. Boncuk filtrasyonu

NOT: Boncukların akış sitometrisine göre QC'si (adım 8) yüksek oranda partikül gösteriyorsa (% 70 veya daha yüksek), boncuk süspansiyonunu aşağıdaki protokolü kullanarak filtrelemeyi düşünün (Şekil 2).

  1. Adım 7.5'te tamamlanan TCPP boncuk süspansiyonunun 0,8 mL'sine 3,20 mL buz gibi soğuk HBSS ekleyin (beş kat seyreltme oluşturur).
  2. Seyreltilmiş boncuk süspansiyonunu 15 s boyunca maksimum hızda vorteks.
  3. Pistonu tek kullanımlık 5 mL'lik bir şırıngadan çıkarın.
  4. Şırıngayı cam elyaf uçlu bir filtreyle (5 μm, 13 mm çap) takın.
  5. Şırıngaya 4 mL HBSS ekleyin.
  6. Vorteksli seyreltilmiş boncuk süspansiyonundan 0,5 mL ekleyin (adım 9.2).
  7. Süspansiyonu şırınga/filtre düzeneğinden yaklaşık 2 damla/sn hızında filtrelemek için pistonu kullanın.
  8. Boncukları, filtreden geçirerek şırıngaya 5 mL taze HBSS çekerek yaklaşık 2 damla / s'de yıkayın.
  9. HBSS'yi yaklaşık 2 damla/sn hızla atık konteynerine tekrar itin.
  10. Boncukları filtreden çıkarmak için, filtreden şırıngaya 5 mL daha taze HBSS çekin.
  11. Filtreyi şırıngadan dikkatlice çıkarın.
  12. Boncuk süspansiyonunu şırıngadan 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne çıkarın.
  13. Filtreyi tekrar şırıngaya yerleştirin ve 9.10-9.12 arasındaki adımları dört kez daha tekrarlayın. Ardından filtreyi ve şırıngayı atın.
  14. Adım 9.1'deki tüm boncuklar filtrelenene kadar 9.2-9.13 arasındaki adımları yineleyin. Her seferinde taze bir şırınga kullanın ve filtreleyin.
  15. Filtrelenmiş boncuk süspansiyonlarını oda sıcaklığında 1.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  16. Her 50 mL'lik tüpün süpernatantını aspire edin ve boncukları 0,5 mL taze HBSS'de birleştirerek yavaşça askıya alın.
  17. Boncukları p1.000 mikropipetle yeni bir kehribar, cam veya polipropilen şişeye aktarın ve 4 °C'de saklayın.
  18. Filtrelenmiş boncuk süspansiyonundaki TCPP ile ilişkili partiküllerin oranının azalıp azalmadığını belirlemek için 8. adımı tekrarlayın. Temsili sonuçlar için bkz: Şekil 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Boncukların TCPP etiketlemesi için bu protokol nispeten hızlı ve verimlidir. Şekil 1, akış sitometrisi ile belirlenen TCPP boncuk etiketleme işleminin temsili bir sonucunu göstermektedir. Şekil 1A, TCPP'yi tespit etmek için uygun kanalda tespit edildiği gibi Gökkuşağı boncuklarının standartlaştırılmış profilini göstermektedir. Bu boncuklar, TCPP'nin akış sitometresi tarafından tespiti için lazer voltajlarının standardizasyonu için ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Porfirinlerin kanser tanı ve terapötiklerinde birçok uygulamasına rağmen2, primer insan dokularında kanserli ve kanserli olmayan hücre popülasyonlarının tanımlanmasında akış sitometrik reaktifi olarak potansiyel kullanımları hakkında sınırlı literatür vardır24,25,26. İnsan balgamının akış sitometrik analizi üzerine yaptığımızaraştırma 24,27

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Tüm yazarlar bioAffinity Technologies'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

David Rodriguez'e, Navios EX akış sitometresinin kullanımı için şekil hazırlama ve Hassas Patoloji Hizmetleri (San Antonio, TX) ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

Referanslar

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669(2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303(2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943(2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478(2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046(2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002(2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069(2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785(2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 193Ak sitometrisikompanzasyon kontrolfloroforetiketlemeamin i levli boncuklaramidasyonporfirin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır