Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Özet

Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.

Özet

Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde ilk savunma hatlarından biri olarak bilinir ve kemotaksis, ters göç, fagositoz, sitotoksik enzimlerin ve metabolitlerin degranülasyonu ve DNA'nın nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) olarak salınması gibi birçok özel hücresel işlevi yerine getirebilir. Nötrofiller sadece kendilerini sıkı bir şekilde düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin düzenlenmesine de katılırlar. Taze nötrofiller terminal olarak farklılaştığından, kısa ömürlü olduğundan ve bireyler arasında oldukça değişken olduğundan, toplanan örneklerden en iyi şekilde yararlanmak önemlidir. Araştırmacıların, değerlendirilen belirli koşullardan etkilenebilecek birçok nötrofil fonksiyonuna genel bir bakışı değerlendirmek için genellikle tarama testleri yapmaları gerekir. Bu ihtiyacı karşılamak için normal yoğunluktaki nötrofillerin tek bir izolasyon sürecini takip eden bir dizi test geliştirildi ve hız, kapsamlılık, maliyet ve doğruluk arasında bir denge arandı. Sonuçlar, derinlemesine takip çalışmalarına akıl yürütmek ve rehberlik etmek için kullanılabilir. Bu prosedür ortalama 4 saat içinde gerçekleştirilebilir ve hücre canlılığının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin, gerçek zamanlı göçün ve cam slaytlar üzerinde mayanın fagositozunun değerlendirilmesini içerir ve omik çalışmalar gibi daha ayrıntılı yaklaşımlar için yeterli hücre bırakır. Ayrıca, prosedür, ışık mikroskobu ile gözlenen hızlı panoptik boyamadan sonra, bu şekilde daha fazla çabanın faydalı olup olmayacağını belirtmek için yeterli olsa da, spesifik belirteçlerin eksikliği ile NET'lerin bir ön önerisini kolayca gözlemlemenin bir yolunu içerir. Test edilen fonksiyonların çeşitliliği, testler arasındaki ortak noktaları birleştirerek analiz süresini ve masraflarını azaltır. Prosedür NeutroFun Screen olarak adlandırıldı ve sınırlamaları olmasına rağmen, yukarıda belirtilen faktörleri dengeler. Ayrıca, bu çalışmanın amacı kesin bir test seti değil, her laboratuvarın kaynaklarına ve taleplerine göre kolayca ayarlanabilen bir kılavuzdur.

Giriş

Nötrofiller, insan kanında en bol bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir ve enfeksiyon ve iltihaplanmada önemli bir rol oynadıkları bilinmektedir ve doku hasarı^{bölgesine ilk} ulaşan ilk müdahale ekipleridir 1. Son yıllarda, nötrofillerin çeşitli hastalıklarda ve homeostazı desteklemede oynadığı önemli rol giderek daha fazla kabul görmektedir². Nötrofiller sadece kendilerini sıkı bir şekilde düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin düzenlenmesine de katılırlar ^3,4,5. Bu nedenle, nötrofil....

Protokol

Tüm deneyler, Brasilia Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından belirlenen etik yönergeleri sıkı bir şekilde takip etti (süreç 13364819.0.0000.5558) ve örnekler, bağışçı anonimliğini sağlamak için kodlarla tanımlandı. Hücreler, bilgilendirilmiş onam belgesini imzalayan ve aşağıdaki uygunluk kriterlerini karşılayan 18-35 yaşları arasındaki normal sağlıklı erkek donörlerden elde edildi: sigara içmeyenler / gazeteler, kronik sağlık sorunları yok ve son 14 gün içinde inflamatuar durum öyküsü yok.

1. Kan alma

1. Heparinlemek için 0.3 mL 5.000 IU / mL heparini (Malzeme Tablosuna bakınız) ster....

Tartışmalar

Nötrofiller, kısa ömürlü ve henüz dondurularak saklanamayan oldukça dinamik ve duyarlı hücrelerdir¹⁹, bu da biyolojilerinin araştırılmasını zorlaştırır. Bu nedenle, canlı, zenginleştirilmiş ve dinlenen nötrofiller elde etmek için dikkatli adımlar atmak önemlidir^11,20. Bu çalışma, nazik ve minimal manipülasyonun yanı sıra aktivasyon adımına kadar düşük sıcaklıkların kullanımını vurgulayan yoğunluğa.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software