Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Özet

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Özet

Mitokondri, enerji üretimi, lipid metabolizması, kalsiyum homeostazı, heme biyosentezi, düzenlenmiş hücre ölümü ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik fonksiyonlar için gereklidir. ROS, anahtar biyolojik süreçler için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, kontrolsüz olduklarında, mitokondriyal hasar da dahil olmak üzere oksidatif hasara yol açabilirler. Hasarlı mitokondri daha fazla ROS salgılar, böylece hücresel hasarı ve hastalık durumunu yoğunlaştırır. Mitokondriyal otofaji (mitopaji) adı verilen homeostatik bir süreç, hasarlı mitokondrileri seçici olarak ortadan kaldırır ve daha sonra yenileriyle değiştirilir. Birden fazla mitopaji yolu vardır, ortak son nokta lizozomlardaki hasarlı mitokondrinin parçalanmasıdır.

Genetik sensörler, antikor immünofloresansı ve elektron mikroskobu dahil olmak üzere çeşitli metodolojiler, mitopajiyi ölçmek için bu son noktayı kullanır. Mitopajiyi incelemek için kullanılan her yöntemin, spesifik doku / hücre hedefleme (genetik sensörlerle) ve büyük ayrıntı (elektron mikroskobu ile) gibi avantajları vardır. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle pahalı kaynaklar, eğitimli personel ve transgenik hayvanlar oluşturmak gibi gerçek deneyden önce uzun bir hazırlık süresi gerektirir. Burada, mitokondri ve lizozomları hedef alan ticari olarak temin edilebilen floresan boyaları kullanarak mitofajiyi ölçmek için uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. Bu yöntem, nematod Caenorhabditis elegans ve insan karaciğer hücrelerindeki mitopajiyi etkili bir şekilde ölçer ve bu da diğer model sistemlerdeki potansiyel verimliliğini gösterir.

Giriş

Mitokondri, insanlar da dahil olmak üzere tüm aerobik hayvanlar için gereklidir. Biyomoleküllerin kimyasal enerjisini oksidatif fosforilasyon¹ yoluyla adenozin trifosfata (ATP) dönüştürürler, heme^2'yi sentezlerler, yağ asitlerini β oksidasyon³ yoluyla parçalarlar, kalsiyum⁴ ve demir⁵ homeostazını düzenlerler, apoptoz⁶ ile hücre ölümünü kontrol ederler ve redoks homeostazında hayati bir rol oynayan reaktif oksijen türleri (ROS) üretirler⁷. İki tamamlayıcı ve zıt süreç, mitokondrinin bütünlüğünü ....

Protokol

NOT: Okuyucuların rahatlığı için, protokolü iki bölüme ayırdık: biri C. elegans'ta mitofajiyi ölçmek için protokole odaklanırken, diğeri karaciğer hücrelerinde mitofajiyi ölçmek için protokole odaklanmaktadır. Malzemelerin listesi sağlanan Malzemeler Tablosunda bulunabilir.

1. C. elegans protokolü

1. Nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarının ve Escherichia coli OP50 bakteri stoğunun hazırlanması
   NOT: Bir açıklama noktası olarak, NGM plakalarının ve OP50 bakteri stoğu^25,26'nın hazırlanması için standart protokolleri takip ederken^,

Tartışmalar

Çoklu mitopaji yolları çeşitli proteinleri ve biyomolekülleri içerir (örneğin, kardiyolipin²⁹). Bununla birlikte, bu yolakların bitiş noktası benzerdir - mitokondrinin lizozomal enzimler tarafından parçalanması^12,13. Gerçekten de, birkaç yöntem mitofajiyi ölçmek için bu son noktayı kullanır. Bununla birlikte, elektron mikroskobu gibi bazı yöntemler, pahalı ekipmanlara, eğitimli uzmanlara ve numuneler ve analizler .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600