Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Özet

İyon kanallarının farmakolojik olarak hedeflenmesi, solid tümörlerin tedavisinde umut verici bir yaklaşımdır. Kanser hücrelerinde iyon kanalı fonksiyonunu karakterize etmek ve iyon kanalı modülatörlerinin kanser canlılığı üzerindeki etkilerini test etmek için ayrıntılı protokoller sağlanmıştır.

Özet

İyon kanalları, hücre gelişimi ve hücre homeostazının korunması için kritik öneme sahiptir. İyon kanalı fonksiyonunun bozulması, çok çeşitli bozuklukların veya kanalopatilerin gelişmesine katkıda bulunur. Kanser hücreleri, kendi gelişimlerini sürdürmek, ayrıca bir tümör olarak gelişmek ve çeşitli kanserli olmayan hücreleri içeren bir mikro ortamda asimile olmak için iyon kanallarını kullanır. Ayrıca, tümör mikroçevresindeki büyüme faktörleri ve hormon seviyelerindeki artışlar, kanser hücresi proliferasyonuna ve hayatta kalmasına katkıda bulunan iyon kanalı ekspresyonunun artmasına neden olabilir. Bu nedenle, iyon kanallarının farmakolojik hedeflemesi, primer ve metastatik beyin kanserleri de dahil olmak üzere katı malignitelerin tedavisinde potansiyel olarak umut verici bir yaklaşımdır. Burada, kanserli hücrelerde iyon kanallarının işlevini karakterize etmek için protokoller ve kanser canlılığı üzerindeki etkilerini belirlemek için iyon kanallarının modülatörlerini analiz etme yaklaşımları açıklanmaktadır. Bunlar, bir iyon kanalı/kanalları için bir hücrenin/hücrelerin boyanmasını, mitokondrinin polarize durumunun test edilmesini, elektrofizyoloji kullanılarak iyon kanalı fonksiyonunun oluşturulmasını ve ilaç gücünü değerlendirmek için canlılık deneylerinin yapılmasını içerir.

Giriş

Membran taşıma proteinleri, hücreler arasındaki iletişimin yanı sıra hücresel homeostazı korumak için kritik öneme sahiptir. Membran taşıma proteinleri arasında iyon kanalları, hücrelerin büyümesini ve gelişmesini yönlendirmeye ve zorlu ve değişen ortamlarda hücrelerin durumunu korumaya hizmet eder. İyon kanallarının ayrıca hem sistemik olarak hem de merkezi sinir sisteminde (CNS) katı tümörlerin gelişimini yönlendirdiği ve desteklediği ^{bildirilmiştir1,2}. Örneğin, KCa3.1 kanalları, hücre döngüsü düzenlemesinde önemli olan membran potansiyelini düzenlemekten ve hücre hacmini kontrol etmekten sorumludur. Kusurlu....

Protokol

1. Kültürlenmiş hücrelerde immüno-etiketleme iyon kanalları

1. Hücrelerin hazırlanması ve deney düzeneği
   1. Hücreleri 75^cm2'lik kültür şişelerinde aktif olarak büyüyen bir kültür olarak muhafaza edin. Kullanılan hücre hattının iki katına çıkma süresine bağlı olarak, hücreleri% 50 -% 90 birleşene kadar bir kez geçirin.
      NOT: Bu çalışmada Grup 3 medulloblastoma hücre hattı olan D283 hücreleri kullanıldı.
   2. Hücreleri kültür şişesinden bir santrifüj tüpüne (15 mL veya 50 mL) toplayın ve yapışkan hücreleri ayırmak için 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin. 5 dakika sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımc....

Tartışmalar

İyon kanalı işlevindeki değişiklikler, bir hücrenin genel işleyişini etkileyebilecek hücre içi sinyal kaskadlarını değiştirir. Son on yılda, iyon kanallarının kanser hücresi büyümesi ve metastazı için önemli olduğu giderek daha açık hale geldi. Daha da önemlisi, birçok iyon kanalı, geniş bir hastalık yelpazesini hedefleyen onaylanmış terapötikler için birincil hedeflerdir²⁴. Araştırmacılar, iyon kanallarının anti-kanser hedefleri olup olamayacağını araşt.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841