Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Özet

Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.

Özet

Fotoreseptör hücrelerin ve retina pigment epitelyal (RPE) hücrelerinin transplantasyonu, retina dejenerasyonu hastalıkları için potansiyel bir tedavi sağlar. Terapötik donör hücrelerin fare alıcılarına subretinal transplantasyonu, fare gözünün küçük hacminin izin verdiği sınırlı cerrahi alan nedeniyle zordur. Fare alıcılarında ekzojen hücrelerin subretinal iletimini kolaylaştırmak için doğrudan transpupiller görme kılavuzluğuna sahip bir transskleral cerrahi transplantasyon platformu geliştirdik. Platform, çubuk açısından zengin Rho::EGFP farelerinden ve koni açısından zengin OPN1LW-EGFP'den toplanan retina hücre süspansiyonları ve üç boyutlu retina tabakaları kullanılarak test edildi ; NRL^-/- fareler, sırasıyla. Canlı/ölü testi, her iki donör hücre formu için düşük hücre mortalitesi gösterdi. Retina greftleri, multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskop (cSLO) görüntüleme ile tespit edilen minimum cerrahi komplikasyonla, bir fare retina dejenerasyonu modeli olan Rd1/NS'nin subretinal boşluğuna başarıyla verildi. Transplantasyondan iki ay sonra, histolojik boyama, retinal greftlerin subretinal boşlukta 'yetişkin' çubuklara ve konilere (sırasıyla sağlam Rho::EGFP, S-opsin ve OPN1LW:EGFP ekspresyonu ile) ileri olgunlaştığına dair kanıtlar gösterdi. Burada, fare alıcılarında düşük komplikasyon oranıyla son derece hassas subretinal doğumu mümkün kılabilen cerrahi bir platform sunuyoruz. Bu teknik, beceri edinmede hassasiyet ve göreceli kolaylık sunar. Ayrıca, teknik sadece subretinal hücre nakli çalışmaları için değil, aynı zamanda gen terapileri de dahil olmak üzere diğer göz içi terapötik çalışmalar için de kullanılabilir.

Giriş

Fotoreseptör ve retina pigmentli epitelyal (RPE) hücrelerin transplantasyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), Stargardt hastalığı ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retinal dejeneratif hastalıklar için potansiyel tedavi sağlar1,2,3,4,5,6,7. Dejenere retinadaki hastalıklı fotoreseptörleri ve RPE hücrelerini yenilemek veya değiştirmek için, konakçı fotoreseptörlerin ve RPE hücrelerinin laminer anatomisi göz önüne alındığında, subretinal boşluk özellikle bir transplantasyon hedefi olarak çok uygundur. RPE hücrelerinin retina altı transplantasyonunun cerrahi prosedürleri büyük hayvanlarda 8,9,10 ve klinik çalışmalarda^11,12,13 iyi kurulmuş olsa da^, fotoreseptör transplantasyonu araştırmalarının karşılaştığı zorluklar arasında transgenik büyük hayvan modellerinin azlığı ve diğer endişelerin yanı sıra nöronal transplantasyonda yer alan derinlemesine sinaptogenez mekanizmalarının sınırlı anlaşılması yer almaktadır. Çeşitli retinal dejenerasyon mutantlarına sahip genetiği değiştirilmiş fare modelleri, transplantasyon bağlamında moleküler mekanizmaları incelemek ve klinik öncesi aşamada^etkili hücre replasman tedavilerinin geliştirilmesini yönlendirmek için yararlı araçlar sağlar 14,15,16,17,18.

Büyük hayvanlarda (örneğin, domuz, maymun) nispeten büyük göz ve küçük kristal merceğin aksine, fare gözlerinin küçük boyutlu ve büyük kristal merceği, özellikle fiziksel alan kısıtlamalarının ve sınırlı doğrudan görselleştirmenin temel zorluklar olduğu subretinal transplantasyon için onları zor cerrahi hedefler haline getirir.

Mevcut yaklaşımlar, enjeksiyon yoluna göre üç ana tipte sınıflandırılabilir. İlk olarak, trans-korneal yaklaşım durumunda, iğne korneadan vitreus boşluğuna ve daha sonra subretinal boşluğa^{geçirilir 19,20}. Bu yöntem kullanılarak başarılı subretinal doğum sağlanabilir, ancak ön segment yapılarındaki (yani kornea, iris, lens) hasar, aşağı akışı ciddi şekilde engelleyebilecek büyük bir risktir in vivo analiz. İkincisi, trans-vitreus yaklaşımı durumunda, iğne vitreus boşluğuna pars plana ve daha sonra subretinal boşluğa^{girer 21}. Bu yaklaşım insanlarda ve büyük hayvanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lens vitreus boşluğunun daha büyük bir nispi hacmini kapladığı için kemirgenlerde potansiyel lens hasarı riski vardır. Özellikle, hem trans-korneal hem de trans-vitreus protokolleri, subretinal boşluğa ulaşmak için nöral retinanın penetrasyonunu gerektirir, bu da konakçı retinaya zarar verir ve penetrasyon deliğinden donör hücre reflü riskini artırır. Üçüncüsü, trans-skleral yaklaşım^22,23 durumunda^, iğne skleral-koroid-RPE kompleksinden geçer ve doğrudan subretinal boşluğa girer. Bu yaklaşım, ön segment yapılarının ve vitreus boşluğunun potansiyel travmasını azaltır. Bununla birlikte, konakçı fundusun doğrudan görüntülenmesi olmadan, trans-retinal ponksiyonlar, RPE dekolmanı ve koroid kanamasının neden olduğu cerrahi başarısızlıklar yaygın olarak tespit edilir.

Burada, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliğine sahip bir trans-skleral cerrahi platform geliştirdik. Transplantasyondan önce donör retina tabakalarının ve hücre süspansiyonlarının canlılığının doğrulanması yapıldı. Donör hücrelerin bir retina dejenerasyonu fare modelinin subretinal boşluğuna başarılı bir şekilde verildiği doğrulandı. Sadece nadir görülen cerrahi komplikasyonlar tespit edildi. Ek olarak, retina greftlerinde nakledilen fotoreseptörler hayatta kaldı ve transplantasyondan iki ay sonra "yetişkin" çubuklara ve konilere ileri olgunlaşma kanıtı gösterdi.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi (NIH Yayınları No. 8023, 1978'de revize edilmiştir) ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Beyanı'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay M021M459).

1. Hayvanlar

1. Rho::EGFP farelerini (P3-P6 yaşlı) retina hücresi süspansiyonlarının donörleri olarak kullanın.
   NOT: Bu tür, Baylor Tıp Fakültesi'nden Dr. T. Wensel'in nazik bir hediyesiydi.
2. OPN1LW-EGFP/NRL^-/- fareleri¹⁴ (P3 yaşlı) retina yapraklarının donörü olarak kullanın.
3. Alıcı olarak immün yetmezliği (her iki cinsiyet) olan yetişkin retina dejenerasyonu Rd1 / NS farelerini kullanın.
4. Tüm fareleri, gerektiğinde suya ve yiyeceğe erişimi olan 12:12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü altında kafeslerde barındırın.

2. Nöral retinayı toplayın (Şekil 1)

NOT: Aşağıdaki tüm adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Araştırma araçları ve ürünlerinin tedarikçi bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Donör farelerin hazırlanması: Donör farelere aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın ve servikal çıkık ile ötenaziyi doğrulayın.
2. Farelerin gözbebeklerini izole edin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Göz küresini ortaya çıkarmak için mikro makas kullanarak yavruların göz kapaklarını dikkatlice açın.
   2. Optik siniri tutmak için yumuşak forseps kullanın ve göz küresini bir çift forseps ile dışarı çekin.
3. Nöral retinayı izole edin
   NOT: Bu adım diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.
   1. 25 G steril iğne kullanarak korneanın ortasında bir delik açın.
   2. Korneayı delikten ikiye bölün ve kesiyi sklera ve RPE'ye doğru genişletin, ardından sklera ve RPE'yi çıkarın.
   3. Nöral retinayı izole etmek için lensi ve vitreusu nazikçe çıkarmak için mikro dişli forseps kullanın.
   4. Gerektiğinde donör retina süspansiyonunu hazırlamak için bölüm 3 veya donör retina tabakasını hazırlamak için bölüm 4 ile devam edin.

3. Donör retina süspansiyonunu hazırlayın (Şekil 1)

1. Nöral retinayı Papain solüsyonunda 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca hücre kümeleri tespit edilmeyene kadar inkübe edin.
   NOT: Hücre karışımını her 10 dakikada bir 15 kez nazikçe pipetleyin.
2. Tek hücreleri toplamak için üreticinin Papain Ayrışma Kiti talimatlarını izleyin.

4. Donör retina tabakalarını hazırlayın (Şekil 1)

NOT: Bu adım bölüm 2'yi takip eder ve diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.

1. İzole edilmiş nöral retina kabını, önceden soğutulmuş steril PBS ile 35 mm'lik bir Petri kabına koyun.
2. Nöral retina kabını birden fazla retina tabakasına (yaklaşık 1 mm x 2 mm) kesmek için mikro makas kullanın.

5. Alıcı fareleri hazırlayın

1. Alıcı fareleri intraperitoneal ketamin (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (20 mg/kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile uyuşturun.
2. Göz kırpma ve ağrı reflekslerinin kaybını, düzenli nefes almayı ve solunumu sağlayarak cerrahi anestezi düzlemini onaylayın.
3. Anestezi derinliğini, kuyruk sıkışması veya pedal reflekslerinin geri çekilmesine yanıt vermeyerek değerlendirin.
4. Ameliyat prosedürü sırasında her zaman anestezik derinliği tekrar kontrol edin ve hayvan ağrıya yanıt veriyorsa anestezik derinliği ayarlayın. Hipotermiyi önlemek için fareleri önceden ısıtılmış ameliyat masasında tutun.
5. Ameliyattan 5 dakika önce alıcı göz bebeklerini %1 (ağırlıkça/hacim) tropikamid göz damlası ile genişletin. İyi genişlemiş bir göz bebeği, ameliyat mikroskobu altında transpupiller görselleştirmeyi kolaylaştırabilir.
6. Çalışan fare gözünü ve çevresindeki oküler dokuları povidon-iyot ile dezenfekte edin, sterilize edilmiş PBS ile yıkayın.
7. Analjezi için fare gözüne% 0.5 Proparakain hidroklorür uygulayın.

6. Retina greftlerinin subretinal transplantasyonu (Şekil 2)

NOT: Aşağıdaki adımların tümü aseptik koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Cerrahi aletler otoklavlandı (alet uçlarını korumak için alet tepsileri kullanın ve lümene sıkışmalarını önlemek için pistonu mikro şırıngalardan çıkarın). Araştırma araçları ve ürünlerinin tedarikçi bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Ön kamara parasentezi: Nakil sırasında göz içi basıncının (GİB) yükselmesini önlemek için sulu hümörün pasif olarak dışarı çıkmasına izin vermek için periferik korneaya bir insülin iğnesi ile ön kamaraya nüfuz edin.
   NOT: Başarılı bir parasentez, kornea deliğinden sulu hümörün dışarı akması ile gösterilir.
2. Cerrahi kapsam altında fundusun transpupiller görselleştirmesini sağlamak için korneanın üzerine bir damla sodyum hyaluronat ve bir cam lamel (5 mm çapında) koyun.
3. Deneyin gerektirdiği şekilde üst veya alt göz duvarına transpupiller görme merkezine doğru bastırarak enjeksiyon lokusunu (1 mm kornea sonrası limbus) ortaya çıkarmak için dişli forseps kullanın.
4. Skleraya dik olarak nüfuz etmek için bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.
5. Sklera-koroid-RPE kompleksinin subretinal boşluğa tam penetrasyonuna izin vermek için iğne yönünü teğetsel olarak dikkatlice döndürün.
6. Terminal enjeksiyon lokusuna erişmek için iğneyi teğet olarak sokun.
   NOT: Transpupiller görme rehberliği ile iğne eğiminin tam konumunu doğrulayın. Subretinal boşlukta doğru iğne konumlandırması için yüzeysel retina damarlarını anatomik bir referans olarak kullanın.
7. Retina greftleri enjekte edin
   NOT: Şırıngaya önceden yüklenmiş küçük kabarcıkların varlığı, donör hücrelerin doğru subretinal konumunun doğrulanmasını kolaylaştırabilir. Subretinal enjeksiyondan kaynaklanan yüksek GİB, donör hücre reflü riskini artırır.
   1. Kornea bulanıklaşırsa^24,25, yüksek GİB'nin bir göstergesi, kornea temizlenene kadar iğneyi en az 3 dakika subretinal boşlukta tutun^, bu da GİB'nin yeterince azaldığının bir göstergesidir.
      NOT: Nadir durumlarda, GİB'nin normale dönmesi daha uzun sürebilir ve 8-10 dakika sürse bile korneanın netliği geri gelene kadar iğnenin yerinde tutulması önerilir. Retina yapılarına zarar vermemek için cerrahi mikroskop altında gözlemleyin.
8. Enjeksiyon deliği kenarını mikro dişli forseps ile kavrayın ve iğneyi hızla geri çekin.
   NOT: Bir retina hücresi süspansiyonunun ve tabakasının başarılı bir şekilde subretinal iletimi için kriterler, sırasıyla subretinal boşlukta sabit bir bleb ve görünür bir beyaz tabakadır.
9. Gözün ameliyat bölgesini suni gözyaşı ile temizleyin ve gerekirse merhem sürün.
10. Ameliyat sonrası uygulama
    1. Nakledilen fareleri önceden ısıtılmış (37 °C) temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin ve sıkıntı olup olmadığını dikkatlice izleyin.
    2. Sıkıntı meydana gelirse cerrahi göze 2-3 kez topikal %0.5 Proparakain Hidroklorür damlatın.
    3. Fareler tamamen uyanık ve hareketli hale geldikten sonra fareleri ev kafesine geri koyun. Fareler yiyecek haznesine ulaşmakta sorun yaşıyorsa, kafese az sayıda yiyecek peleti ve bir jel kabı yerleştirin.
       NOT: Katarakt oluşumunu önlemek için anestezinin etkisi geçene kadar göz yüzeyini nemli tutun.

7. Multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskopi (cSLO) görüntüleme

1. Transplantasyondan iki ay sonra, görüntüleme için intraperitoneal ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (20 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile alıcı Rd1 / NS farelerini (n = 5) uyuşturun.
2. Öğrencileri %1 (ağırlıkça/hacimce) tropikamid göz damlası ile genişletin.
3. Konfokal taramalı lazer oftalmoskop cSLO sistemini kullanarak standart 55° multimodal görüntüleme gerçekleştirin²².
4. 30 kare ART ortalaması kullanarak MR ve SD-OCT görüntüleri elde edin.

8. Histolojik boyama

1. Daha önce bildirildiği gibi nakledilen Rd1 / NS fare gözlerinin donmuş slaytlarını hazırlayın ¹⁴.
2. PBS'de %5 keçi serumu ve %1 Triton X100 karışımı kullanarak nakledilen retinanın donmuş slaytlarını bloke edin ve nüfuz edin.
3. Numuneleri gece boyunca 4 ° C'de primer antikorlarla inkübe edin ve PBS'de durulayın (5 dakika, 3x). Birincil antikorlar arasında keçi anti-GFP-FITC (1:200), tavşan anti-recoverin (1:1000) ve tavşan anti-S-opsin (1:500) bulunur.
4. Numuneleri ikincil antikor (keçi anti-tavşanı Cy3, 1:500) ile inkübe edin ve DAPI ile karşı boyandı.
   NOT: Primer ve sekonder antikor tedarikçileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

Sonuçlar

Retina greftleri başarılı bir şekilde subretinal boşluğa verilir ve in vivo olarak hayatta kalır.
Subretinal transplantasyon platformumuzun performansı, neredeyse tam dış nükleer tabaka (ONL) dejenerasyonu nedeniyle rezidüel retinaları ciddi şekilde inceldiğinde 6-8 haftalık Rd1/NS alıcı farelerde değerlendirildi. Retinanın kırılganlığı, koni fotoreseptörlerinin azlığı ve tabaka donörlerine kıyasla süspansiyondaki hücrelerin nispeten zayıf canlılığı göz önüne alındığında, koni açısından zengin fareler (OPN1LW-EGFP; NRL-^/-)¹⁴, donör retina tabakalarının kaynağı olarak ve hücre süspansiyonları için donör olarak çubuktan zengin fareler (Rho::EGFP) kullanıldı. Koniden zengin retina tabakası ve çubuktan zengin hücre süspansiyonları, enjeksiyondan hemen sonra transpupiller görselleştirme kullanılarak görülen subretinal bleb ve beyaz tabaka ile doğrulandığı gibi, cerrahi platformumuz kullanılarak tüm alıcı farelerin subretinal boşluğuna başarıyla iletildi. Transplantasyondan iki ay sonra, retinal greftlerin durumlarını in vivo olarak izlemek için multimodal cSLO görüntüleme yapıldı. Kesitsel OCT taraması, retina greftlerinin subretinal boşlukta hayatta kaldığını ve tüm alıcı farelerde ONL'yi yeniden oluşturduğunu gösterdi (Şekil 3A). Kızılötesi görüntüleme, nakledilen tüm gözlerde belirgin katarakt tespit etmedi (Şekil 3B). Transplantasyondan iki ay sonra çok renkli reflektans görüntüleme ile transplante edilen retinada (n = 1/10 göz) kanama dahil diğer cerrahi komplikasyonlar nadiren tespit edildi (Şekil 3C). Retina greftlerinde fotoreseptörlerin sağkalımını ve olgunlaşma derecesini daha fazla değerlendirmek için histolojik boyama yaptık. Nakledilen retina tabakalarında OPN1LW:EGFP ve S-opsin eksprese eden bol miktarda koni fotoreseptörleri gözlendi. Benzer şekilde, nakledilen retina hücresi süspansiyonları, çok sayıda Rho::EGFP+ çubuğu dahil olmak üzere in vivo olarak büyük oranda Rec⁺ fotoreseptörleri gösterdi (Şekil 3D). Nakledilmeyen kontrol fareleri, seyrek rezidüel koni fotoreseptörleri (Rec ⁺) ile ciddi ONL dejenerasyonu gösterdi. Transplante edilmeyen Rd1/NS retinada EGFP sinyali saptanmadı (Şekil 3D).

Şekil 1: Toplayıcı donör retina tabakası ve hücre süspansiyonlarının şeması. Donör Rho::EGFP farelerinden retina hücresi süspansiyonlarının ve tabakalarının toplanmasının temel adımlarını gösteren şemalar. Parlak alan ve floresan görüntüleme, ayrışmış hücrelerin temsili görüntülerini ve Rho::EGFP farelerinden izole edilmiş disseke bir tabakayı gösterdi. Sarı noktalı çizgi: insizyonel kenar boşluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Rd1/NS farelerinde retina tabakalarının subretinal transplantasyonu ve hücre süspansiyonu prosedürleri. (A) Alıcı farelerin hazırlanmasının şematik görüntüleri. (B) Retina hücresi süspansiyonlarının ve tabakalarının subretinal transplantasyonunu gösteren temel cerrahi prosedürler ve ilgili diyagramlar. Cerrahi adımlar şunları içerir: 1. ön kamaraya nüfuz edin; 2. Sodyum hiyalüronatı kornea üzerine bırakın, ardından transpupiller görselleştirmeyi kolaylaştırmak için lamel sodyum hiyalüronatın üzerine monte edin; 3. göz duvarının dış katmanlarına nüfuz edin (sklera-koroid-RPE kompleksi). İğnenin penetrasyon açıları resmin sağ üst panelindedir; 4. enjeksiyon iğnesini yerleştirin; 5. Greftleri enjekte edin. Temsili görüntüler, sırasıyla iki ayrı alıcıda retina hücresi süspansiyonlarının ve tabakasının başarılı bir şekilde verildiğini göstermektedir. Yıldız: optik sinir başı; Kırmızı ok uçları: retina kan damarı; Beyaz ok ucu: delinmiş iğne ucu; Beyaz oklar: aşılı retina süspansiyonları veya tabaka. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Retina greftlerinin subretinal boşluğa başarılı bir şekilde verilmesi ve in vivo olarak hayatta kalması. (A) Temsili SD-OCT görüntüleri, sırasıyla iki ayrı Rd1 / NS faresinde nakledilen retina tabakalarının ve hücre süspansiyonlarının subretinal dağılımını gösterdi. Transplante edilmeyen Rd1/NS fareler kontrol olarak toplandı. İlgi Bölgesi (ROI), kızılötesi (IR) fundus görüntülerinde sarı noktalı kutularla gösterilir. İç retina, retina ganglion hücre tabakası (RGC), iç pleksiform tabaka (IPL) ve iç nükleer tabaka (INL) laminaları olarak adlandırılır. (B) Nakledilen bir Rd1 / NS faresinin temsili kızılötesi (IR) görüntüsü, genişlemiş göz bebeğinden katarakt göstermedi. (C) Nakledilen ve nakledilmeyen Rd1 / NS gözlerinin temsili çok renkli yansıtma (MR) görüntüleri. Nakledilen gözlerde kanama da dahil olmak üzere belirgin bir cerrahi komplikasyon görülmedi. (D) Nakledilen (tabaka ve süspansiyon) ve nakledilmeyen (kontrol) Rd1 / NS farelerinin immünohistokimya (IHC) boyama. Veriler, transplantasyondan iki ay sonra fotoreseptörlerin (Rec), çubukların (Rho::EGFP), L/M konilerinin (OPN1LW:EGFP) ve S-konilerin (S-opsin) spesifik belirteçlerini eksprese eden çok sayıda aşılanmış fotoreseptör gösterdi. Alıcı retinal laminalar DAPI boyaması (mavi) ile tanımlandı. Retina greftleri EGFP raportörü (yeşil) tarafından tanımlandı. Nakledilmeyen farelerin retinası, seyrek rezidüel koni fotoreseptörleri ^(Rec+) ile şiddetli ONL dejenerasyonu gösterdi. Transplante edilmeyen Rd1/NS retinada EGFP sinyali saptanmadı. Sağdaki iki panelde büyütülmüş görüntüler sunuldu. Kısaltmalar: RGC: retinal ganglion hücre tabakası; INL: iç nükleer tabaka. ONL: dış nükleer katman. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Farelerde subretinal transplantasyon, fare gözlerinin küçük boyutu nedeniyle teknik olarak zordur. Bu çalışmada, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için basit ve tekrarlanabilir bir platform geliştirdik. Platform, donör canlılığı korumasında tutarlılık, başarılı subretinal doğum sağlar ve düşük komplikasyon oranı sağlar.

Burada tasvir edilen subretinal transplantasyon tekniği, enjeksiyon iğnesinin göz duvarının dış katmanlarına (sklera-koroid-RPE kompleksi) nüfuz ettiği trans-skleral yola dayalı olarak geliştirilmiştir. Trans-korneal^19,20 ve trans-vitreus^21,26,27 yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, trans-skleral yaklaşım^, ön segment yapılarına ve nöral retinaya nüfuz etmeden doğrudan subretinal boşluğa girer^, böylece zararsız bir nakil sağlar ve delici delikten donör hücre reflüsü riskini azaltır. Transskleral yaklaşımın bir zorluğu, iğne ucunun terminal doğum bölgesine gelmeden önce subretinal boşluk boyunca yayılmasını sağlarken, bitişik RPE ve koroid katmanlarının potansiyel rahatsızlığını önlemektir. Doğrudan görsel rehberlik olmadan geleneksel bir transskleral yaklaşımla^28,29 bu hedeflere ulaşmak zordur. Bu çalışmada, fare modellerinde subretinal transplantasyonu kolaylaştırmak için cerrahi mikroskop ve retinanın dış aydınlatmasını kullanarak transpupiller görme kılavuzluğunda bir platform geliştirdik. Platform, alıcı fundusun cerrahi mikroskop altında gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayarak operatörün cerrahi süreci ve alıcıların retina durumunu izlemesine olanak tanır. Örneğin, sklera-koroid-RPE kompleksinin başarılı bir şekilde penetrasyonu, transpupiller görselleştirme yoluyla iğne ucunun nispeten parlak bir yansıması ile basitçe doğrulanabilir. Daha da önemlisi, transpupiller görselleştirme ile yönlendirildiğinde, operatör, iğne ile alıcı retinadaki anatomik yapılar (örneğin, retina damarları ve optik sinir başı) arasındaki göreceli konuma göre enjeksiyon açısını ve derinliğini doğru bir şekilde modüle edebilir. Ayrıca, bu tekniği kullanarak materyallerin doğru bir şekilde uygulanması, RPE, koroid travması ve diğer cerrahi komplikasyonları en aza indirebilir. Gerçekten de, transpupiller görselleştirme yardımıyla retina kan damarlarına yakın manevralardan kaçınarak kanamaların en aza indirilebileceğini bulduk.

Donör hücrelerin reflüsü, enjeksiyon sonrası cerrahi başarısızlığın önemli bir nedenidir^29,30. Donör hücre reflüsünü teşvik etmede rol oynayan birçok faktör vardır. Enjekte edilen donör hücre karışımlarının neden olduğu alıcı gözlerin yüksek göz içi basıncı (GİB), hücrelerin göz dışına geri akışını destekleyen önemli bir faktördür. Protokolümüz, ameliyatın başlangıcında ön kamara penetrasyonu ile alıcıların GİB'sini azaltır ve vitreus iğnesini vitreus boşluğundan çekmeden önce GİB'nin sulu sıvı çıkışı ile kendiliğinden düşmesini sağlar. İkinci bir faktör, alıcıların gözlerindeki kapatılmamış enjeksiyon tünelidir. Greft reflüsünün enjeksiyon tünelinden geri dönmesini önlemek için, göz duvarına nüfuz ederken kendinden sızdırmaz bir tünel oluşturmak için küçük boyutlu bir mikro enjeksiyon iğnesi (34G) ve iğneyi çekerken dış tünel açıklığının kenarlarını tutmak için dişli mikro forseps kullanıyoruz. Konvansiyonel transplantasyonda, reflü greftler hızlı bir şekilde oluşabildikleri veya hızla dağılabildikleri için zor tespit edilirler. Sodyum hyaluronat, lamel uygulandığında, sklerotomi bölgesi de dahil olmak üzere limbus ve skleranın çoğunu kaplamak için neredeyse her zaman korneadan kayar. Hücre enjeksiyonunu takiben, sklerotomi bölgesindeki sodyum hiyalüronat, varsa geri akışlı içeriklerin toplu akışını yavaşlatmaya ve cerrahi mikroskop altında görsel olarak tespit edilebilir hale getirmeye yardımcı olabilir. Ayrıca, reflü yokluğu, optik koherens tomografinin (OCT) mevcut olmadığı laboratuvarlar için yararlı olabilecek protokolümüzü kullanarak hücre süspansiyonları için subretinal blebin sabitliğini ve retina tabakasının göz içi konumunu izleyerek de doğrulanabilir.

Nakledilen retina tabakalarında önemli sayıda fotoreseptör hücresi hayatta kalırken, fark edilebilir bir hücresel oryantasyon veya tabaka oryantasyonu tespit edilemedi. 3D retina tabakalarının büyük hayvanlara verilmesi 26,31,32 olarak tespit edilmiş olmasına rağmen, farelerde subretinal boşluk, intraoperatif retinal görüntüleme yeteneğinin eksikliği ile birleştiğinde^, intraoperatif olarak ve hemen postoperatif dönemde tabaka oryantasyonunun korunmasını sağlamayı çok zorlaştırır.

Fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliğine sahip bir transskleral cerrahi platform tanımladık. Bu platform, yüksek enjeksiyon doğruluğu ve düşük cerrahi komplikasyon oranı sağlar. Bu platform, bilinen hücre dozlarının kesin olarak verilmesini sağlar, öğrenmesi nispeten kolaydır ve gen terapisi de dahil olmak üzere farklı terapötik ajan türleri için intra-retinal veya intravitreal enjeksiyonlara ek olarak subretinal iletimi kolaylaştırır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears	CareAll	P31447-04
Coverslips (5mm in diameter)	Deckglaser	N/A
Goat anti-GFP (FITC)	Abcam	Ab6662
Goat-anti-rabbit Cy3	Invitrogen	A10520
Insulin syringe (30G)	Easy Touch	08496-3015-11
Ketamine	VETone Zetamine	AH2017J
Live Dead Viability Kit	Thermo Fisher Scientific	L3224
Micro scissor	Harvard Apparatus	72-8503
Micro smooth forceps	ASICO	AE-4360
Micro toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Microinjection needle (26G)	Hamilton	7804-03
Microinjection needle (34G)	Hamilton	207434
Microinjection syringe	Hamilton	7633-01
Papain dissociation kit	Worthington Biochemical	LK003150
Petri-dish (35 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB012920
Povidone-iodine (10%)	Betadine Solution	N/A
Proparacaine Hydrochloride (0.5%)	Keeler	AX0500
Rabbit anti-recoverin	Millipore	Ab5585
Rabbit anti-S-opsin	Millipore	Ab5407
Sodium hyaluronate	Johnson & Johnson Vision	10-2400-11
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 2PC
Sterile needle (25G)	BD PrecisionGlide Needle	305122
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical materials/reagents
Tropicamide ophthalmic solution	Henry Schein	112-7192
Xylazine	AnaSed Injection	N/A