Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Özet

Burada, Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ile çalışmak, büyümeyi, plazmid dönüşümünü, koloni PCR'sini, floresan muhabir protein ölçümünü ve sınırlı plazmid mini hazırlığını detaylandırmak için protokollerin yanı sıra yaygın sorunları ve sorun gidermeyi sunuyoruz. Bu protokoller, DSM20016'daki muhabir proteinlerinin ölçülmesine veya muhabir dahil değilse koloni PCR ile doğrulanmasına izin verir.

Özet

Lactobacillus , birçoğu gastrointestinal sistem içindeki sentetik biyolojik çabalar için bir şasi olarak kullanılma potansiyeline sahip kommensal suşlar olan 261 türden oluşan inanılmaz derecede büyük, çeşitli bir bakteri cinsiydi. Cins içinde gözlenen geniş fenotipik ve genotipik varyasyon, yakın zamanda yeniden sınıflandırılmasına ve 23 yeni cinsin tanıtılmasına yol açmıştır.

Eski cins içindeki varyasyonların genişliği nedeniyle, bir üyede gösterilen protokoller diğer üyelerle ilan edildiği gibi çalışmayabilir. Belirli suşların tam olarak nasıl manipüle edileceğine dair merkezi bilgi eksikliği, genellikle diğer bakteri ailelerinden uyarlanan bir dizi geçici yaklaşıma yol açmıştır. Bu, hangi bilgilerin seçtikleri suş için geçerli olup olmadığını bilmeyen alanda başlayan araştırmacılar için sorunları karmaşıklaştırabilir.

Bu yazıda, özellikle Limosilactobacillus reuteri suşu tanımı F275'te (diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) başarı gösteren bir dizi protokolü, sorun giderme önerileri ve karşılaşılabilecek yaygın sorunlarla birlikte merkezileştirmeyi amaçlıyoruz. Bu protokoller, L. reuteri DSM20016 ile çalışma deneyimi çok az olan veya hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının bir plazmidi dönüştürmesini, dönüşümü doğrulamasını ve bir muhabir proteini aracılığıyla bir plaka okuyucusundaki sistem geri bildirimini ölçmesini sağlamalıdır.

Giriş

Lactobacillus cinsi tarihsel olarak gram-pozitif, çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, fakültatif anaeroblar veya öncelikle laktik asit¹ üretmek için şekerleri parçalayan mikroaerofiller olarak sınıflandırılmıştır. Bu gevşek kriterler, Lactobacillus'un fenotipik ve genotipik olarak son derece çeşitli bir cins olmasına yol açtı. Bu geniş kategorizasyon, cinsin yeniden sınıflandırılmasına neden oldu ve 2020'de 23 yeni cins tanıtıldı².

Eski, daha geniş cins, genellikle tüketim için güvenli (GRAS) olarak kabul edilen başlıca kommensal ve probiyotik türleri içeriyordu³. Lactobacillaceae ailesi, çeşitli suşların tüketimi yoluyla verilen birçok sağlık yararı nedeniyle halkın 'iyi bakteri' olma algısını sürdürmektedir 4,5,6,7. Gastrointestinal sistem^8'de gezinme kolaylığı ve halkın kabulü, Lactobacillaceae suşlarını yutulabilir tıbbi, terapötik veya tanısal uygulamalar için şasi organizmaları kadar güçlü adaylar olarak konumlandırmak için birleşir.

Lactobacillaceae familyasında bulunan çok çeşitli özellikler, fiili model-organizma suşunun olmadığı bir duruma yol açmıştır; Araştırma grupları, kendi özel amaçlarıyla en alakalı özelliklere sahip türleri seçme eğilimindedir. (Örneğin, süt fermantasyon laboratuvarları L. lactis'i seçebilir; bitkisel fermantasyon çalışmaları L. plantarum'u seçebilir; probiyotikler üzerine yapılan araştırmalar L. acidophilus'a odaklanabilir; vb.)

Türler arasındaki bu aynı geniş özellik yelpazesi, Lactobacillaceae familyasının bir alt kümesi için iyi çalışabilecek, ancak diğerlerinde verimli bir şekilde çalışmak (veya belki de hiç çalışmamak) için optimizasyon gerektiren protokollerin ve prosedürlerin birikmesine yol açmıştır⁹. Aile üyeleri arasında ve hatta aynı türün üyeleri arasında bile optimizasyon ihtiyacı, yabancı araştırmacıların çabalarını boşa çıkarabilir. Makalelerin yöntemler bölümlerinde yayınlanan protokoller, parçalanmış, merkezi olmayan protokol koleksiyonlarına yol açan kendi modifikasyonlarını da içerebilir¹⁰.

L. reuteri, memeli, kuş¹¹ ve balık¹² gastrointestinal (GI) kanallarında tutarlı bir şekilde bulunan yaygın bir omurgalı kommensal olarak kabul edilir. L. reuteri alt suşları genellikle, mukus adezyon proteini adaptasyonu yoluyla, spesifik yerli konakçıları daha kalıcı olarak kolonize etmek için genetik olarak uzmanlaşmıştır ^8,11,13. GI yolu Limosilactobacillus türleri, doğal konakçılarının dışındaki konakçılarda izole edilebilir, ancak geçici bir doğaya doğru daha fazla eğilimlidir⁸.

İnsan-konakçı uzmanlığı nedeniyle, L. reuteri DSM20016 kendisini insan GI kanalının herhangi bir noktasında tanısal veya terapötik uygulamalar için bir şasi olarak çok iyi konumlandırır ve gerinim DSM20016, daha geçici suşlara kıyasla müdahaleler için daha uzun süreli bir etki penceresi sağlayabilir.

Bu yazıda, Limosilactobacillus reuteri'de (suş tanımı: F275; diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) etkinliği kanıtlanmış bir dizi protokolün yanı sıra, moleküler ve sistem biyolojisi uygulamalarına yardımcı olmak için diğer kaynaklardan gelen suş hakkında merkezi bilgileri özetledik. Burada ortaya konan prosedürler, L. reuteri kültürüne daha önce hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının, elektroyetkin stoklar oluşturmasına, dönüştürülmüş kolonileri seçmesine, koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR ) yoluyla dönüşümü doğrulamasına ve floresan muhabir proteinleri aracılığıyla tasarlanmış sistem tepkisini ölçmesine olanak sağlamalıdır.

İlgili protokollerin L. reuteri'de (suş: ATCC-PTA-6475)14 CRISPR-Cas9 yardımlı ssDNA genom recombineringini ve çoklu L. reuteri'de CRSIPR-Cas9 nickaz destekli genom düzenlemesini kapsadığını not ettik. reuteri, Lactobacillaceae familyası lekeleri ^15,16; ancak bunlar, burada odak noktamız olan L. reuteri DSM20016 suşu ele almamaktadır.

Protokol

1. L. reuteri DSM20016 elektrokompetan hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu, Rattanachaikunsopon ve ark. tarafından bilgilendirilen santrifüjleme hızları ile Berthier ve ^ark.17 tarafından hazırlanan bir protokole dayanmaktadır.¹⁸.

1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, L. reuteri'yi gliserol stoğundan 6 mL deMan Rogosa Sharpe (MRS) suyuna aşılayın. Statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
2. Ertesi sabah, gece kültürünün 4 mL'sini 200 mL MRS suyuna (1:50 seyreltme) aşılayın.
3. 600 nm optik yoğunluk değeri (OD600) 0.5-0.85'e ulaşana kadar statik bir 37 ° C inkübatörde aerobik olarak büyümesine izin verin; Bu yaklaşık 2-3 saat sürmelidir.
4. Yeterli bir OD600 değerine ulaşılır ulaşılmaz, ortamı 50 mL santrifüj tüplerine boşaltın ve tüpleri dengelerken buzun üzerine yerleştirin.
5. Önceden soğutulmuş, 4 °C santrifüjde 5.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
6. Süpernatanı atın, her bir pelet 50 mL önceden soğutulmuş (0 °C ila 4 °C) ddH₂O'da tekrar askıya alın ve önceki adımla aynı ayarlarla tekrar santrifüj yapın. Hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
7. 1.6. adımı yineleyin.
8. Her bir pelet 25 mL ddH₂O: 0.5 M sakaroz,% 10 gliserol içinde tekrar askıya alın. 10 dakika boyunca 4 °C'de 5.000 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve hücreleri tekrar buzun üzerine koyun.
9. Tüm peletleri aynı 2 mL ddH₂O: 0.5 M sakaroz,% 10 gliserol içinde tekrar askıya alın.
10. Önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerinde 50 μL ila 100 μL porsiyonlara aliquot; Daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

2. L. reuteri'nin elektroporasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlarda mümkün olduğunca pipetlemeden kaçının. Antibiyotik seçiminin yeterli olmasını sağlamak için plazmid eklenmemiş bir kontrol elektroporasyonunun dahil edilmesi önerilir.

1. Tüm elektroyetkin L. reuteri aliquot'u alın ve buz üzerinde çözün.
2. 5 μL ila 10 μL plazmidi (nihai plazmid konsantrasyonu >6 nM) çözülmüş aliquot'a yavaşça karıştırın ve pipetlemeyi mümkün olduğunca önleyin.
3. Buz soğutmalı, 1 mm boşluklu elektroporasyon küvetine aktarın.
4. 1,25 kV, 400 Ω ve 25 μF'de elektroporat.
5. 1 mL oda sıcaklığında (RT) MRS suyu ekleyin ve küveti bir veya iki kez ters çevirerek karıştırın.
6. İyileşmeyi sağlamak için küvetleri 2,5-3 saat boyunca 37 ° C'de statik bir inkübatöre yerleştirin.
7. Tüm miktarı uygun seçimle birden fazla MRS agar plakasına plakalayın.
8. Tabakları, küçük yanan bir mum ("çay ışığı") ve anaerobik atmosfer oluşturan bir poşet ile tamamen hava geçirmez bir kabın içine yerleştirin.
9. 37 ° C'de 2-3 gün boyunca veya görünür koloniler bulunana kadar büyütün.

3. Aside dayanıklı floresan muhabir proteini mCherry2'nin ölçümü

1. Ölçüm için gerekli kolonileri seçin ve kuyu başına 1,5 mL filtre sterilize (otoklavlanmamış) MRS suyu ve uygun bir seçim antibiyotiği içeren 96 delikli bir depolama mikroplakasına aşılayın.
2. Gece boyunca 24 saat boyunca 37 ° C'de titremeden aerobik olarak inkübe edin.
   NOT: Bu depolama mikroplakası, bölüm 4'te (koloni PCR) kullanılmak üzere saklanmalıdır.
3. L. reuteri , durağan fazdayken medyadan çökelecektir; pipetleme yoluyla gecelik kültürü yeniden askıya alın.
4. 200 μL'yi düz, şeffaf tabanlı, 96 delikli bir plakaya aktarın, plakayı bir plaka okuyucuya aktarın ve mCherry2'nin (uyarma [Ex]: 589 nm; emisyon [Em]: 610 nm) veya diğer ilgili muhabirlerin OD ve floresansını ölçün.

4. Koloni PCR ile plazmid alımının doğrulanması

1. Bölüm 3'teki 96 delikli depolama mikroplakasından, 5 μL'yi bir PCR tüpüne aktarın.
   NOT: >5 dakika geçtiyse, L. reuteri'yi ikinci kez askıya almak gerekebilir.
2. Portatif bir tezgah üstü mikrosantrifüjde, pelet görülebilene kadar aşağı doğru döndürün (2.000 x g'de kabaca 2 dakika), süpernatanı atın ve peleti 20 μL'lik 20 mM NaOH'da yeniden askıya alın.
3. 95 ° C'de 5 dakika kaynatın, vorteks yapın ve kaynatmayı ikinci kez tekrarlayın.
4. Numuneleri hemen soğutun; Şablon bozulması ve PCR inhibisyonu olasılığını azaltmak için aşağıdaki adımlarda örnekleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutmaya çalışın.
5. Hücre enkazı peletlenene kadar 2 dakika boyunca 2.000 x g'de taşınabilir bir tezgah üstü mikrosantrifüjde döndürün, ardından süpernatantın 1 μL'sini alın ve 99 μL buz gibi soğuk DNaz ve RNaz içermeyen ddH₂O'ya (100x seyreltme) seyreltin.
6. Plazmid-spesifik primerler kullanarak standart bir PCR reaksiyonunda şablon DNA olarak 100x seyreltmeyi kullanın. E. coli mini prep'ten türetilen bir plazmid ile pozitif bir kontrol ekleyin.
7. Numuneleri buz üzerinde geri koyun ve 1x konsantrasyonda uygun bir yükleme boyası ekleyin.
8. TAE tamponunda (tris-asetat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) 30 dakika boyunca 110 V'ta% 1 agaroz jeli içinde çalıştırın. Gerekirse görüntü.

5. L. reuteri için mini hazırlık protokolü, ardından plazmid varlığını doğrulamak için PCR

NOT: Protokol, Malzeme Tablosunda listelenen mini hazırlık kiti ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

1. L. reuteri'yi uygun bir antibiyotik içeren 10 mL MRS suyuna aşılayın ve statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
2. Önceden soğutulmuş 4 °C santrifüjde 10 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj.
3. Pelet, sonraki adımlara müdahale edebilecek asitliği ortadan kaldırmak için 2 mL standart P1 tamponunda (kit ile birlikte verilir) yıkayın, daha önce tarif edildiği gibi aynı ayarla santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
4. Bakteri hücrelerini lize etmek için peleti 10 mg/mL lizozim ve 100 U/mL mutanolizin içeren 250 μL modifiye P1 tamponunda tekrar askıya alın. 37 ° C'de 1-2 saat inkübe edin.
5. 250 μL tampon P2 ekleyin, dört ila altı kez ters çevirerek karıştırın ve RT'de 5 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
6. 350 μL tampon N3 (kit ile birlikte verilir) ekleyin ve karıştırmak için hemen dört ila altı kez yavaşça ters çevirin.
7. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.
8. Bir spin kolonuna mümkün olduğunca fazla süpernatant aktarın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
9. Sıkma kolonunu 500 μL tampon PB (kit ile birlikte verilir) ile yıkayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
10. Sıkma kolonunu 750 μL tampon PE (kit ile birlikte verilir) ile yıkayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın. Kalan tamponları gidermek için akışı atın ve 60 sn boyunca santrifüj yapın.
11. Sıkma sütununu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Spin kolonunun filtresine 20-30 μL DNAse- ve RNAse-free_ddH2O uygulayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapmadan önce 1-2 dakika bekletin.
12. Plazmid-spesifik primerler (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) kullanarak standart bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin, eluate şablon DNA'yı sağlar. E. coli mini prep'ten türetilen bir plazmid ile pozitif bir kontrol ekleyin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan PCR ayarları şunlardır: 5 dakika boyunca 98 °C, (30 s için 98 °C, 30 s için 55 °C, 45 s için 72 °C) 30 döngü, 2 dakika boyunca 72 °C, 4 °C tutma. Parametreler, kullanılan polimeraz, parça uzunluğu ve bu protokolü kullanan herhangi bir kişi tarafından kullanılan kesin primerlere büyük ölçüde bağlıdır.

Sonuçlar

Dönüşüm verimlilikleri
L. reuteri, diğer Lactobacillaceae^19,20 için gözlemlendiği gibi dcm-/dam^- metillenmemiş plazmid gerektirmez (bkz. Şekil 1). L. reuteri DSM20016'nin 8.5 kb plazmid pTRKH3_mCherry2'nin 10 μL'si (replikasyonun pAMβ1 teta kökeni) ile elektroporasyonu, plazmid metilasyon durumundan bağımsız olarak, kabaca 80 koloni oluşturan birimi...

Tartışmalar

L. reuteri DSM20016'nin dönüşümü için en kritik adım, dönüşümler kaplandıktan sonra anaerobik büyüme koşullarının oluşturulmasıdır; Aerobik koşullarda kazanılan koloniler sadece çok nadirdir ve MRS suyunda aşılandığında genellikle büyüyemez. Koloni büyümesi olasılığını en üst düzeye çıkarmak için tüm geri kazanım hacminin kaplanması da uygulanmalıdır. Bu iki kritik adımda bile, dönüşüm verimliliği hala deneyler üzerinde bir sınırlamadır, çünkü beklenen ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production