CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Özet

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

Özet

CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar) / Cas9 sistemi, çeşitli organizmalarda hassas ve verimli gen düzenleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Sentromer ile ilişkili protein-E (CENP-E), kinetokor-mikrotübül yakalama, kromozom hizalaması ve mil montaj kontrol noktası için gerekli olan artı uca yönelik bir kinesindir. CENP-E proteinlerinin hücresel fonksiyonları iyi çalışılmış olmasına rağmen, CENP-E proteinlerinin doğrudan fonksiyonlarını geleneksel protokoller kullanarak incelemek zor olmuştur çünkü CENP-E ablasyonu genellikle iğ montaj kontrol noktası aktivasyonuna, hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne yol açar. Bu çalışmada, insan HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık ve CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E^-/- HeLa hücrelerini başarıyla ürettik.

Hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere, CENP-E nakavt hücrelerinin tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını etkili bir şekilde artıran üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Önemli olarak, CENP-E delesyonu, kromozomun yanlış hizalanmasına, BUB1 mitotik kontrol noktası serin / treonin kinaz B (BubR1) proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur. Ayrıca, CENP-E'ye özgü inhibitörler için bir tanımlama yöntemi geliştirmek için CENP-E nakavt HeLa hücre modelini kullandık.

Bu çalışmada, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yararlı bir yaklaşım oluşturulmuştur. Ayrıca, bu makale, hücre bölünmesinde CENP-E mekanizmalarını araştırmak için güçlü bir araç olabilecek CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E gen düzenleme protokollerini sunmaktadır. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hattı, antitümör ilaç geliştirme, hücre biyolojisinde hücre bölünme mekanizmaları çalışmaları ve klinik uygulamalar için önemli etkileri olan CENP-E inhibitörlerinin keşfine ve doğrulanmasına katkıda bulunacaktır.

Giriş

Tasarlanmış genom düzenleme, çeşitli hücrelerde ve organizmalarda genlerin hedeflenen modifikasyonlarına aracılık eder. Ökaryotlarda, bölgeye özgü mutajenez, hedef DNA^1'in homolog rekombinasyonunu uyaran diziye özgü nükleazların uygulanmasıyla tanıtılabilir. Son yıllarda, çinko parmak nükleazları (ZFN'ler)^2,3, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler)^4,5 ve güdümlü meganükleazlar ^6,7 dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomlar....

Protokol

1. CRISPR/Cas9 gen nakavt vektörlerinin oluşturulması

1. İnsan CENP-E genindeki hedef genomik DNA dizisini seçin (GenBank Erişim No. NM_001286734.2) ve çevrimiçi bir CRISPR tasarım aracı (http://crispor.tefor.net/) kullanarak sgRNA'yı tasarlayın.
2. Tek bir genomik dizi girin, "Homo sapiens-insan-UCSC Aralık 2013 (hg38 analiz seti) + tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler): dbSNP148" genomunu seçin ve "20 bp-NGG-spCas9" protospacer bitişik motifini seçin. Özgüllük skorları⁵⁰, tahmin edilen verimlilik¹⁰ ve minimum hedef dışı değerlere göre sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3....

Tartışmalar

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi ^17,19,20 sırasında kromozom hizalamasında ve iğ montaj kontrol noktasında önemli bir düzenleyicidir. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonu, hücre döngüsü durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır 27,29,51,52.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.