Yükleme Yüzeyinin Gömülmesi ile Fare Lomber Vertebra Tek Eksenli Kompresyon Testi

Özet

Bu protokolde, fare bel omurlarının tek eksenli kompresyon testini daha ulaşılabilir hale getirmek için iki yaklaşım tanımlanmıştır. İlk olarak, üç noktalı bir bükme makinesinin bir sıkıştırma test makinesine dönüştürülmesi açıklanmaktadır. İkinci olarak, kemik çimentosu kullanan yükleme yüzeyini hazırlamak için bir gömme yöntemi, fare bel omurları için uyarlanmıştır.

Özet

Kortikal ve süngerimsi kemiğin, yaşa bağlı kemik kaybı için farmasötik tedavileri, hormon tedavilerini ve diğer tedavileri düzenlemede ve bunlara yanıt vermede farklılık gösterdiğine dair artan bir farkındalık vardır. Üç noktalı bükme, bir tedavinin kortikal kemik açısından zengin olan uzun kemiklerin orta diyafiz bölgesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Fare omurlarının tek eksenli kompresyon testi, süngerimsi kemik açısından zengin kemikleri değerlendirebilmesine rağmen, teknik zorluklar nedeniyle daha az sıklıkla yapılır. Daha az yaygın olarak gerçekleştirilen daha da yaygın olarak, bir tedavinin uzun bir kemiğin orta diyafiz bölgesini ve bir vertebral merkezini benzer veya farklı şekilde nasıl etkileyebileceğini belirlemek için üç noktalı bükme ve kompresyon testinin eşleştirilmesidir. Burada, fare bel omurlarının kompresyon testini üç noktalı bükmeye paralel olarak gerçekleştirmek için daha az zorlayıcı bir yöntem haline getirmek için iki prosedürü açıklıyoruz: birincisi, üç noktalı bir bükme makinesini bir sıkıştırma test makinesine dönüştürmek için bir prosedür ve ikincisi, bir fare bel omuru yükleme yüzeyi hazırlamak için bir gömme yöntemi.

Giriş

Yaşa bağlı kemik değişiklikleri, bu değişikliklerle ilişkili kemik kırığı riskinin artması nedeniyle yaygın olarak sorunlu olarak kabul edilmektedir. İnsanlarda kemik kırıkları kronik ağrıya, hareket kabiliyetinin azalmasına, uzun süreli sakatlığa, ölüm riskinin artmasına ve ekonomik yüklere yol açabilir¹. Yaşa bağlı kemik değişikliklerinin semptomlarını ele almak için araştırılan yaygın tedaviler arasında diyet takviyeleri, hormon tedavileri ve^ilaçlar 2,3,4,5,6,7,8,9 bulunur. İnsan denekler için bu tür tedavilerin ilk araştırmaları, genellikle insan iskeletinde bulunan iki ana kemik tipine sahip olan küçük hayvan modelleri (örneğin, laboratuvar fareleri ve fareler) kullanılarak yapılır¹⁰. Humerus, femur ve tibia gibi apendiküler uzun kemikler kortikal (yani kompakt) kemik açısından zengindir, omurlar ise süngerimsi kemik (yani dokuma, süngerimsi veya trabeküler kemik) açısından ^zengindir4. Kemik regülasyonu ve sinyal yollarının mekanizmalarının kortikal kemik (örneğin, uzun kemik orta diyafiz) ve süngerimsi kemik (örneğin, vertebral merkez) arasında farklılık gösterdiğine dair artan bilgiler ^vardır2. Bu nedenle, tedavilerin aynı kemik içinde kemiğe özgü ve hatta bölgeye özgü farklı etkileri olabilir ^2,3,4.

Bir cisme (örneğin kemiğe) kuvvet uygulanması, cismin sınır koşullarına bağlı olarak cismin ivmeye, deformasyona veya her ikisine birden uğramasına neden olur. Kemik kısıtlandığında, eşit büyüklükte zıt bir kuvvet kemiğin hızlanmasına direnir ve deformasyon meydana gelir. Kemik deformasyonu sürdürürken, stres adı verilen iç direnç üretilir ve bunun iki temel türü vardır: Gerilim veya sıkıştırma şeklinde normal kuvvet ve kesme kuvveti¹⁰. Genellikle, uygulanan kuvvet sistemine¹⁰ bağlı olarak temel stres türlerinin bir kombinasyonu üretilir. Bir malzemenin gücü, bozulmadan strese dayanma yeteneğidir. Bir malzemeye giderek daha büyük kuvvetler uygulandıkça, sonunda kalıcı deformasyona uğrar, bu noktada elastik bir durumdan (yani, kuvvet kaldırılırsa orijinal şekline geri döneceği) plastik bir duruma (yani, kuvvet kaldırılırsa orijinal şekline geri dönmeyeceği) geçtiği ^söylenir.11. Elastik halden plastik hale geçişin gerçekleştiği noktaya akma noktası denir. Malzemeye akma noktasının ötesinde daha da büyük kuvvetler uygulandıkça, toplam kırılma meydana gelene kadar mikro kırıkları (yani hasarı) giderek daha fazla sürdürür; Bu noktada, malzemenin ^11,12'de başarısız olduğu söyleniyor. Bir kemiğin kırılması hem yapısal düzeyde hem de doku^{düzeyinde 10} yetmezliği temsil eder. Örnek olarak, bir vertebral kemiğin kırılması, yalnızca çoklu trabeküllerin yapısal düzeyde başarısız olması değil, aynı zamanda doku düzeyinde bireysel bir trabekülde kollajen ve hidroksiapatit kristalleri gibi hücre dışı matris elemanlarının da başarısız olması nedeniyle meydana gelir.

Bir malzemenin arızalanmasına yol açan mekanik olaylar, çeşitli test yöntemleri kullanılarak ölçülebilir. Üç noktalı bükme, apendiküler iskeletten uzun kemiklerin mekanik özelliklerini test etmek için yaygın bir yöntemdir. Bu yöntem basit ve tekrarlanabilirdir, bu da onu birçok araştırmacı için tercih edilen biyomekanik test yöntemi haline getirir¹³. Bu yöntem, iki alt destek kirişi üzerinde duran uzun bir kemiğin orta diyafizinin üzerine bir çaprazkafa kirişi indirerek, yoğun bir şekilde organize edilmiş kortikal kemik olan orta diyafiz bölgesinin mekanik özelliklerini spesifik olarak test eder. Yük-yer değiştirme eğrilerinden, diğer özelliklerin yanı sıra elastikiyet, tokluk, kırılmaya kadar olan kuvvet ve kemik malzemelerinin elastikten plastik davranışına geçiş üzerindeki çekme kuvveti etkileri belirlenebilir.

Trabeküler, süngerimsi, dokuma veya süngerimsi kemik olarak adlandırılan ikinci kemik tipinde, kemik elemanları trabekül adı verilen bir dizi çubuk ve kiriş halinde oluşturulur ve "süngerimsi" bir görünüm verir. Ana vertebral cisimler (yani centra) süngerimsi kemik açısından zengindir ve genellikle insanlarda yaşa bağlı kompresyon kemiği kırıklarının bölgeleridir¹⁴. Bel (yani bel) omurları en büyük omurlardır, vücudun ağırlığının çoğunu taşır ve omur kırıklarının en yaygın olduğu yerdir^15,16. Eksenel kompresyon, in vivo vertebral kolonlara uygulanan normal kuvvet yükü olduğundan, omur gövdelerinin mekanik özellikleri en iyi şekilde tek eksenli kompresyon testi yöntemleri kullanılarak doğrudan değerlendirilebilir ¹⁷. Omurga cisimciklerinin in vivo sıkışması, kas ve bağ kasılmaları, yerçekimi kuvveti ve yer reaksiyon kuvvetlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkar¹⁸.

Küçük hayvan omurlarının ex vivo kompresyon testi, küçük boyutları, düzensiz şekilleri ve kırılganlıkları nedeniyle zor olabilir. Vertebra cisimlerinin şekli, hafif ventral eğim ve hafif kraniyal içbükeylik¹⁷ ile bir paralelkenar olarak tahmin edilebilir. Bu şekil, ex vivo tek eksenli sıkıştırma testine ulaşmak için zorluklar sunar, çünkü yükleme yüzeyine yeterli hazırlık yapılmadan, yükleme yüzeyinin sadece bir kısmına basınç kuvvetleri uygulanacak ve bu da "yerel temas" ile ^{sonuçlanacaktır17,19}. Bu, tutarsız sonuçlara ve erken başarısızlığa neden olabilir¹⁹. İn vivo durum böyle değildir, çünkü yükleme yüzeyi vertebral eklemlerde intervertebral disklerle çevrilidir, bu da yükün kraniyal uç plaka boyunca dağıtılmasına izin verir. İntervertebral disk-kraniyal uç plaka kompleksi, vertebral gövde boyunca kuvvet uygulanmasında ve vertebral gövdeye kırık biyomekaniğinde önemli bir rol oynar^14,20. Kompresyon testi biyoloji alanında yeni olmasa da, kemiklerin mekanik testlerinin mevcut yöntemlerinde sınırlamalar vardır. Bu sınırlamalar, kemik mekaniği için öngörücü modellerin ve simülasyonların eksikliğini, benzersiz geometrik uzamsal mimariyi ve hatta doğal örneklem tabanlı biyolojik varyasyonları içerir²¹. Daha da önemlisi, bu alan, yöntemler arasında standardizasyon eksikliği ve literatürde rapor edilen yöntemlerin genel eksikliği ile karşı karşıyadır²².

Tek eksenli kompresyon testi elde etmek için kemirgen bel omurlarının hazırlanması için literatürde bildirilen iki yöntem vardır: kesme yöntemi ve gömme yöntemi 17,19,23,24,25,26. Kesme yöntemi, vertebral süreçlerin, kraniyal uç plakanın ve kaudal uç plakanın omur gövdesinden kesilmesini gerektirir. Pendleton ve ^ark.19 daha önce bu yöntemin fare bel omurlarında kullanımı için ayrıntılı bir yöntem bildirmişlerdir. Bu yöntem, hem kaudal hem de kraniyal uç plakalarında mükemmel paralel kesimler elde etmenin zorluklarını ortaya koyarken aynı zamanda numuneye herhangi bir zarar gelmesini önler. Ayrıca kraniyal uç plakanın çıkarılması sınırlaması vardır. Kraniyal uç plakası yoğun bir kortikal kemik kabuğu içerir ve intervertebral disklerden in vivo yüklerin dağıtılmasında önemli bir rol oynar ve in vivo kırıklar için kemiğin yetmezliğinde rol oynar 17,20,27. Buna karşılık, gömme yöntemi, omur gövdesinin kraniyal uç plakasını sağlam tutarken vertebral süreçlerin çıkarılmasını içerir. Yükleme yüzeyi daha sonra omur gövdesinin kraniyal ucuna az miktarda kemik çimentosu yerleştirilerek yaklaşık olarak yatay hale getirilir. Bu yöntem, kesme yöntemiyle ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelmesi ve kraniyal uç plakanın korunması nedeniyle in vivo yük uygulama mekanizmasını ve kemik yetmezliğini daha iyi taklit etme avantajına sahiptir. Bu yaklaşım daha önce sıçan kemikleri üzerinde tek eksenli kompresyon testini içeren çalışmalarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, daha önce daha küçük fare bel omurları bağlamında belgelenmemiştir 17,25,26. Söz konusu yöntem daha önce Chachra ve ^ark.25 tarafından detaylandırılmıştı ve orijinal olarak, her biri silindirik bir boşluğa sahip iki plaka arasında tutulan ve daha sonra polimetilmetakrilat (PMMA) ile doldurulmuş bir kemik örneği kullandı. Aynı araştırma grubu daha sonra bir ucun hafifçe zımparalandığı (kaudal) ve diğer ucuna küçük bir kemik çimentosu noktası eklendiği (kraniyal) yöntemi ^{geliştirdi26}. Bu yöntem, merdaneler arasındaki malzemeyi en aza indirdiği ve bu makalenin odak noktası olduğu için önceki yönteme göre bir gelişmedir. Tek eksenli vertebral kompresyon testi ile ilgili zorluklara rağmen, özellikle üç nokta bükme ile eşleştirildiğinde, önerilen bir tedavinin kemik üzerindeki etkileri hakkında değerli bilgiler sağlayabilecek bir yöntemdir.

Burada, tek bir makine kullanılarak hem uzun kemiklerin hem de omur gövdelerinin kolayca test edilmesini sağlamak için dönüştürülebilir üç noktalı eğilme/basma test cihazının kullanımı sunulmaktadır. Ayrıca, fare bel omurlarının tek eksenli kompresyon testini elde etmek için bir gömme yönteminin kullanımı sunulmuştur. Bu çalışma, diyet kenevir tohumu takviyesinin genç, büyüyen dişi C57BL / 6 farelerinde^iskelet kemiğinin özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçlayan daha büyük bir çalışmanın parçası olarak gerçekleştirilmiştir ^5,6. Üç noktalı bükme test cihazı ilk olarak Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo'daki Mühendislik Bölümü'ndeki öğretim üyeleri ve öğrenciler tarafından inşa edildi ve araştırma grubumuz tarafından uzun kemikler üzerinde üç noktalı bükme testlerinde kullanıldı [sıçan femur ve tibia⁷ ve fare humerus, femur ve tibia 5,6,8,9 ]. Bununla birlikte, fare vertebral vücut kompresyon testinde kullanım için modifikasyonu ve uygulaması araştırılmamıştır. Üç noktalı bükme makinesinin tasarımı ve yapımı daha önce açıklanmıştır⁷. Bu rapor, sıkıştırma testi için makineyi değiştirmek ve sistem yer değiştirmesini düzeltmek için kullanılan yöntemlere odaklanacaktır. İkinci olarak, fare vertebral gövdesi yükleme yüzeyi hazırlığı için gömme yöntemi, tek eksenli sıkıştırma testi ve yük-yer değiştirme verilerinin analizi için yöntemler ile birlikte açıklanmaktadır.

Protokol

Tüm deneyler ve protokoller, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nden onay almıştır (Protokol Numarası: 000-000A-021). Hayvan bakımı için ayrıntılı prosedürler daha önce açıklanmıştır ^5,6. Fareler, kenevir tohumu takviyeli bir diyetin genç, büyüyen dişi C57BL / 6 fareleri üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçlayan daha geniş bir çalışmanın parçası olarak üç haftalıkken elde edildi (bkz. 5 ila 29 haftalıkken, fareler üç diyetten birinde yetiştirildi: kontrol (% 0 kenevir tohumu), 50 g / kg (% 5) kenevir tohumu veya 150 g / kg (% 15) kenevir tohumu, grup başına sekiz fare ^5,6. Çalışma boyunca, fareler kendi diyetlerine ve sularına ad libitum erişimine sahipti, polikarbonat kafeslere yerleştirildi ve 12 saatlik bir ışık: 12 saat karanlık döngüsünde (ışıklar 06: 00 - 18: 00 saatleri arasında açıkken) tutuldu. Farelerin kilosu ve sağlığı haftalık olarak değerlendirildi ve tüm fareler herhangi bir olumsuz sağlık koşulu geliştirmeden çalışmayı başarıyla tamamladı. Yirmi dokuz haftalıkken, fareler izofluran gazı kullanılarak derin anestezi altına alındı ve servikal çıkık yoluyla ötenazi^{yapıldı 5,6}. Sternumdan kuyruğa kadar ventral yüzeyde orta hat insizyonu yapıldı ve tüm intratorasik, peritoneal ve retroperitoneal organlar karkaslardan çıkarıldı. İçi boşaltılmış karkaslar, yaklaşık bir yıl sonra meydana gelen omur testi için kemik diseksiyonu zamanına kadar -70 °C'de% 0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde korundu.

1. Üç noktalı bükme makinesinin sıkıştırma test makinesine dönüştürülmesi

1. Üç noktalı bükme makinesindeki⁷ yük sensörüne bağlı çaprazkafa kirişini sökün (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1A,B).
2. Kendinden hizalı bir üst plakayı, çaprazkafa kirişiyle aynı diş ile yük sensörüne (Malzeme Tablosuna bakın) vidalayın (Şekil 1C).
3. Alt plakanın daha sonra takılacağı alt desteklerin her birine iki yatay delik açın (Şekil 1D).
4. Alt desteklerdeki delinmiş deliklerle hizalamak için dişleri paslanmaz çelik alt plakanın iki tarafına hafifçe vurun (Şekil 1E).
5. Dişli altıgen vidalar kullanarak alt plakayı iki alt desteğe sabitleyin ve sabitlenene kadar sıkın (Şekil 1F).
   NOT: Altıgen vidalar, alt desteklerdeki ve üst/alt plakalardaki dişli deliklerle eşleşen dişlere sahip olmalıdır. Kendinden hizalı bir üst plakanın kullanılması, üst plaka ile yükleme yüzeyi arasında düzgün bir temas sağlanmasına yardımcı olabilir, ancak vertebral gövdelerin kraniyal ucunun içbükeyliği göz önüne alındığında yeterli değildir. Bir yükleme yüzeyi hazırlama yöntemi kullanılarak daha fazla hazırlık gereklidir. Birçok endüstriyel/mühendislik malzemesinden daha küçük ve daha zayıf olan küçük hayvan kemikleri için bir sıkıştırma test cihazı inşa ederken, yük sensörünün yük kapasitesini ve yük çerçevesinin boyutunu dikkate almak önemlidir. Ek olarak, doğru sonuçlar ve sorunsuz çalışma sağlamak için makineler düzenli olarak temizlenmeli ve yağlanmalıdır.

2. Sıkıştırma test makinesinin yer değiştirmesinin düzeltilmesi

1. Üst plaka ile alt plaka arasında test malzemesi yokken, hafif temas sağlanana kadar (~0.3-0.5 N ön yük kuvveti) üst plakayı alt plakaya indirin.
2. Sıkıştırma testine başlamak için makineyi sabit bir indirme hızında (~1 mm/dak) açın. Mekanik testlerin veri toplaması için dijital veri toplama yazılımını (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak yük (N) ve yer değiştirme (mm) ölçümlerini toplayın.
   NOT: Üst ve alt plaka arasında herhangi bir malzeme olmadığından, gözlemlenen tüm yer değiştirmeler yalnızca makinenin (Δx_makinesi) (şasi, yük hücresi, plakalar, kaplinler vb.) yer değiştirmesinden kaynaklanacaktır.
3. Tüm kemik örneklerinden elde edilecek kuvvetten daha yüksek kuvvetlere ulaşılana kadar üst plakayı sabit (yani monotonik) bir hızda alt plakaya indirmeye devam edin.
4. 2.1'den 2.3'e kadar olan adımları toplam üç kez tekrarlayın.
5. Sistem yer değiştirmesi (Δx_makine, mm) ile karşılaştırılan verileri çizin. uygulanan yük (Kuvvet, N).
6. Verilere en uygun regresyon çizgisini sığdırın (Şekil 2A-D).
7. Kemik kompresyon testinden elde edilen verileri içeren bir elektronik tabloda, bir fare lomber vertebra kompresyon testinin bir veri noktası için kaydedilen yer değiştirmeyi (Δx_{toplam kaydedilen}) etkileyen makine yer değiştirme miktarını (Δx_makinesi) belirlemek için regresyon analizi tarafından sağlanan denklemi kullanın.
   NOT: Örneğin, 18 N kuvvetin uygulandığı ve 2.730 mm yer değiştirmenin kaydedildiği (toplam kaydedilen Δx) bir veri noktası düşünün. Örnek üçüncü dereceden polinom regresyon denklemine göre (Şekil 2D) [Δx_makine = (4 × 10-7 x Uygulanan Yük ³) - (8 × ^10-5 x Uygulanan Yük²) + (0.0044 x Uygulanan Yük)], kaydedilen yer değiştirmenin 0.056 mm'si makine yer değiştirmesinden (Δx_makinesi) kaynaklanmaktadır.
   Δx_{toplam kaydedildi=} Δx_makine + Δx_numune
8. Veri noktası için kaydedilen ötelemeyi düzeltin.
   NOT: Örneğin, yukarıdaki örneği ele alalım. 2.730 mm yer değiştirme kaydedilirse (Δx_{toplam kaydedildi}) ve makine yer değiştirmesi ₍Δx_makinesi) toplamın 0.056 mm'sini oluşturuyorsa, ilgilenilen numunenin (yani kemik) maruz kaldığı yer değiştirme (Δx_örneği) 2.664 mm'dir. Bu nedenle, 2.664 mm, omurun maruz kaldığı gerçek yer değiştirmedir (Δx_örneği) ve yük-yer değiştirme eğrisi analizi için kullanılacak değerdir.
   Δx_numune = Δx_{kaydedilen toplam numune -} Δx_makine
9. Her bir örnek (kemik) için toplanan her veri noktası için 2.7-2.8 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Bu adım önemlidir, çünkü sıkıştırma testi sırasında gözlemlenen yer değiştirme sadece numunenin yer değiştirmesinden kaynaklanmaz, bunun yerine gözlemlenen yer değiştirme, makine yer değiştirmesinin (Δx_makinesi) (örneğin, çerçevenin, yük hücresinin, plakaların, kaplinlerin vb. sıkıştırılması/yer değiştirmesi) ve numunenin (Δx_numunesi). Bu nedenle, küçük bir hayvanınki (örneğin, fare) gibi nispeten küçük miktarlarda yer değiştirmeye maruz kalan numuneler için, sistem yer değiştirmesi (Δx_makinesi) büyük hatalara neden olabilir. Sistemin yer değiştirmesini düzeltmek için burada açıklanan prosedürler daha önce Kalidindi ve Abusafieh²⁸ tarafından rapor edilmişti ve burada açıklanana ek olarak diğer iki yöntemi de detaylandırıyordu. Bazı araştırmacıların sistem yer değiştirmesini belirlemek için birden fazla yöntem kullandıkları belirtilmiştir¹⁷. Her makine, üzerine yükler uygulandığında benzersiz desenler ve sistem yer değiştirme dereceleri gösterebilir. Bu nedenle, sistem yer değiştirme düzeltme faktörü her makine için belirlenmelidir ve herhangi iki makine arasında aynı olmayacaktır. Bir omur kemiğinin kompresyon testinin aksine, üst ve alt plaka arasında hiçbir malzeme olmadığı için sistem yer değiştirmesi ölçülürken büyük bir kuvvet azalması gözlenmeyecektir.

3. 5^{. bel} omurunun (L5) fare karkasından diseksiyonu

1. Dondurulmuş fare karkasını oda sıcaklığında çözdürün, düzenli olarak %0,9 NaCl'lik izotonik bir çözelti uygulayarak yumuşak dokuları ve kemikleri nemli tutmaya özen gösterin.
2. Kuyruğun tabanına yakın dorsal orta hattaki deride küçük (<0,5 cm) bir kesi yapın, ardından kesiği her bir arka bacak boyunca uzatın ve postu kuyruğun tabanından hayvanın kafasına çıkarmak için hafifçe çekin.
3. Vertebral kolon kolayca görünene kadar karın duvarı kaslarını kesin.
4. Diseksiyon mikroskobu altında, iki sakroiliak eklemi ve sakrumun kraniyal ucunu görselleştirin.
5. Bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak, son bel omurunu (L6) sakrumun kraniyal ucundan ayırmak için ince bir kesim yapın.
6. Yine, intervertebral boşluk arasında keserek, L6 ve L5'i vertebral kolondan çıkarın ve analiz için L5'i bir kenara koyun (Şekil 3).
7. Omuru diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve intervertebral disk de dahil olmak üzere tüm yumuşak dokuları çoğunlukla gazlı bez kullanarak ve gerektiğinde forseps ile nazikçe çıkarın.
   NOT: Bu çalışmada ilgilenilen omur olarak L5 seçilmiştir, ancak kompresyon testi için diğer bel omurları da seçilebilir.

4. PMMA kemik çimentosu gömme yöntemi kullanılarak tek eksenli kompresyon testi için L5 vertebra yükleme yüzeyinin hazırlanması

1. Döner bir alete bağlı bir elmas kesme çarkı (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak, enine ve dikenli işlemi çıkarmak için her pedikülde bir kesim yapın (Şekil 4). Merkeze bağlı bırakılırsa, vertebral süreçler, yükün merkez boyunca dağılımının aksine, süreçlerin kendisinde üst/alt plakalarla yerel temaslara neden olabilir.
2. Tüm intervertebral diskleri, yumuşak dokuyu ve düzensizlikleri gidermek için 120 kumlu ince zımpara kağıdı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak omurun kuyruk ucunu nazikçe zımparalayın.
3. Daha sonra kolay tanımlama için zımparalanmış kuyruk ucunu kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
4. PMMA kemik çimentosunu üreticinin talimatlarına göre karıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).
5. PMMA kemik çimentosu hala yarı yumuşakken, omurun kraniyal (işaretsiz) ucuna yukarı bakacak şekilde minimum miktarda yerleştirin ve kemik örneğini nemli ve serin tutmak için omur tuzlu su banyosunda otururken tüm yüzeyin kaplandığından emin olun.
6. PMMA hala yarı yumuşakken, omuru kaudal (işaretli) tarafı aşağı bakacak şekilde alt plakaya yerleştirin (Şekil 5).
7. Tahrik dişlilerini devreye sokmak için makineyi açın ve kemik çimentosu ile temas sağlanana ve PMMA'yı kemik yüzeyine eşit olarak dağıtmak için minimum kuvvet (<0,5 N) uygulanana kadar üst plakayı omur + PMMA kemik çimentosu kompleksi üzerine yavaşça indirin. Nötr konumdaki üst plaka yatay olarak tahmin edilebilir ve yarı yumuşak PMMA'ya basıldığında, PMMA'nın omurun kraniyal ucundaki içbükeyliği doldurmasına ve üst plakanın altında düz bir yatay yüzey oluşturmasına neden olur.
8. Üst plaka PMMA kemik çimentosuna hafifçe bastırırken, PMMA kemik çimentosu tamamen sertleşene kadar numunenin rahatsız edilmeden oturmasına izin verin (bu çalışmada kullanılan PMMA kemik çimentosu için üreticinin talimatlarına göre ~ 10 dakika). Numuneyi tuzlu su banyosunda tutun veya numuneyi nemli ve serin tutmak için bu süre zarfında sık sık tuzlu su ile buğulayın.
9. PMMA kemik çimentosu tamamen sertleştikten sonra kompresyon testi başlayabilir. Mekanik testlerin veri toplaması için tasarlanmış dijital yazılımı kullanarak sensörlerden gelen yük (yani kuvvet) (N) ve yer değiştirme (yani sapma) (mm) için verileri gerçek zamanlı olarak bir elektronik tabloya toplayın (bkz.
10. <0,5 N'lik minimum ön yük kuvvetinde uygulanan 5 sn boyunca temel veri toplama işleminden sonra, sıkıştırma testini başlatmak için (~1 mm/dak) üst plakayı numune üzerine tek (yani monotonik), önceden belirlenmiş bir indirme hızında indirmeye başlayın.
11. Malzeme arızasını gösteren yükte (N) büyük bir azalma gözlemlendiğinde veri toplamayı durdurun.
    NOT: Üretici talimatları, PMMA kemik çimentosu için yaklaşık sertleşme süresini belirtecektir. PMMA kemik çimentosu için sertleşme süresi, kullanılan PMMA kemik çimentosu tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. PMMA sertleşmesi için bekleme süresini belirlemek için üretici talimatlarını izleyin. Bununla birlikte, PMMA kemik çimentosu tamamen sertleştiğinin bir göstergesi olarak, PMMA kemik çimentosu ek bir numunesi, omur üzerine yerleştirilecek numune ile aynı anda karıştırılabilir, ancak bir kenarda tutulabilir ve hala yumuşak veya tamamen sertleşmiş olup olmadığını kontrol edebilir. Tamamen sertleşirse, bu kemik üzerindeki PMMA'nın da kemik + PMMA kompleksini bozmadan tamamen sertleştiğini gösterebilir. Kemik numunesi, PMMA sertleştirme ve test periyotları boyunca iyi nemlendirilmiş ve soğuk kalmalıdır. Kuru havaya birkaç dakika kadar kısa bir süre maruz kalmak, biyomekanik özelliklerde değişikliklere neden olabilir. Bazı araştırmacılar tuzlu su banyosu ile donatılmış kompresyon test cihazları kullanmaktadır¹⁹. Bu çalışmada basma test cihazında tuzlu su banyosu yoktu. Bunun yerine, PMMA sertleştirme periyodu ve test periyodu boyunca düzenli olarak ince bir tuzlu su sisi uygulandı.

5. L5 vertebra tek eksenli basma testleri için yük-yer değiştirme eğrilerinin analizi

1. Yük (N) ve düzeltilmiş yer değiştirme (mm) verilerini elektronik tablodan kopyalayıp teknik bir grafik ve veri analizi yazılımına yapıştırın (bkz.
2. Y ekseninde yük (N) ve x ekseninde düzeltilmiş numune yer değiştirmesi (Δx_numune, mm) ile bir grafik oluşturun (Şekil 6). Bunu yazılımda önce Windows, Yeni Tablo'ya tıklayarak yapın, ardından bir tablo yapmak için yapın . Düzeltilmiş ötelemeyi (mm) kopyalayın ve ham veri elektronik tablosundan yeni tabloya yükleyin (N).
3. Ardından, Veri'ye tıklayarak ham verileri temsil edecek bir dalga formu oluşturun, ardından XY Çifti - Dalga Formu'na tıklayın ve X-Wave için düzeltilmiş yer değiştirme verilerini seçin ve Y-Wave için verileri yükleyin. "Nokta Sayısı" kutusunda doğru sayıda veri noktası olduğundan emin olun, dalga biçimini adlandırın ve ardından Dalga Biçimi Yap'a tıklayın. Bir dalga formu oluşturulduktan sonra, Windows'a, ardından Yeni Grafik'e tıklayarak bir grafik oluşturun ve dalga formunu Y eksenine yerleştirin ve X eksenine "hesaplandı".
4. Analiz için grafikte ilgi çekici noktaları/bölgeleri işaretlemek için imleç aracını kullanın. Yaygın tam kemik mekanik özelliklerini hesaplamak için ilgi çekici noktalardan/bölgelerden birkaçı adım 5.4-5.8'de belirtilmiştir (Şekil 6) ve işten arızaya (N x mm), maksimum yük (N), sertlik (N/mm), akma yükü (N) ve akma sonrası yer değiştirmeyi (mm) içerir.
5. İşten başarısızlığa (N x mm) hesaplanması için, testin başlangıcına bir imleç (A) ve malzeme arızalanmadan hemen önceki noktaya bir imleç (B) yerleştirin (yani, yükte büyük bir azalma gözlemlenmeden önce test sırasında ulaşılan maksimum yüke).
   NOT: Bu nedenle, A-B imleçleri, malzemenin kuvvetlere dayanmaya başladığı ve malzemenin başarısız olduğu noktaya kadar yer değiştirmeye başladığı andan itibaren testin tamamını parantez içine alacaktır. İşten başarısızlığa (N x mm), eğrinin altındaki toplam alan (yani, A ve B imleçleri arasındaki eğrinin altındaki alan) olarak ölçülebilir.
6. Test sırasında gözlemlenen yük için en yüksek değer olarak maksimum yükü (N) hesaplayın (yani, B imlecindeki yük).
7. Malzemenin sertliğini (N/mm) doğrusal elastik bölgenin eğimi olarak hesaplayın (yani, C ve D imleçleri arasındaki eğim).
8. Akma yükü (N), yük-yer değiştirme eğrisinin doğrusallıktan saptığı ve plastik bölgeye girdiği, böylece kalıcı deformasyonu (yani D noktasındaki yükü) sürdürdüğü yüktür. Bunu, D imlecindeki yükü ölçerek hesaplayın.
9. Akma sonrası yer değiştirme (mm), bir malzemenin sünekliğinin bir göstergesidir. Bunu, akma noktası ile malzeme kırılma noktası arasındaki yer değiştirme olarak ölçün (yani, D ve B imleçleri arasındaki yer değiştirme).
   NOT: Yukarıda listelenen parametreler, bildirilen yaygın tüm kemik mekanik özelliklerinden sadece birkaçıdır. Bir yük-yer değiştirme eğrisinden elde edilebilecek tüm tüm kemik mekanik özelliklerinin tam bir listesi değildir. Diğer tüm kemik mekanik özellik parametreleri arasında toplam yer değiştirme (mm), emilen elastik enerji (N x mm), elastik yer değiştirme (mm), emilen plastik enerji (N x mm) ve plastik yer değiştirme (mm) sayılabilir. Ayrıca, doku düzeyinde kemik mekanik özellikleri listelenmemiştir; Bunlar, kemik çapı gibi belirli anatomik ölçümler kullanılarak veri dönüşümleri gerektirir. Yazılımdaki yük-yer değiştirme eğrisinden ölçümler yapmak için örnek kod Ek Dosya 1'de listelenmiştir.

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, tek eksenli kompresyon testinden önce fare bel omurlarının hazırlanması için dönüştürülebilir üç noktalı bükme makinesi/kompresyon test makinesinin yapımını ve PMMA kemik çimentosu gömme yönteminin kullanımını tanımlamaktı. Kemik örnekleri için tanımlayıcı istatistikler elde edilmiş ve raporlanmıştır, bu istatistikler ileride yapılacak çalışmalarda karşılaştırma için faydalı olacaktır. Bu çalışmada en sık bildirilen tüm kemik mekanik özelliklerinden bazıları analiz edilmiştir. Bununla birlikte, burada araştırılmayan birkaç ek tam kemik ve doku düzeyinde mekanik özellik olduğunu belirtmekte fayda var.

Gömme yöntemi kullanılarak hazırlanan örneklerden elde edilen mekanik özelliklerin, fare bel omurları için kesme yöntemi kullanılarak hazırlananlarla nasıl karşılaştırıldığı belirsizliğini korumaktadır. Schumancher¹⁷ daha önce iki farklı yöntem kullanılarak hazırlanan sıçan omurlarının mekanik özelliklerini değerlendirmiş ve gömme yöntemi kullanılarak hazırlanan omurların, kesme yöntemi kullanılarak hazırlanan örneklere göre önemli ölçüde daha düşük sertliğe, daha yüksek verim yer değiştirmesine ve daha yüksek verim gerilimine sahip olduğunu bulmuştur. Farelerin veya diğer hayvan modellerinin vertebral mekanik özelliklerinin, iki farklı yükleme yüzeyi hazırlama yöntemi kullanılarak ölçüldüğünde nasıl karşılaştırıldığını anlamak için daha fazla karakterizasyona ihtiyaç vardır. Gömme yönteminin örneğe materyal eklediği ancak in vivo vertebral kırıklarda önemli bir yapı olan uç plağı koruduğu göz önüne alındığında, farklı yöntemler kullanılarak hazırlanan omurlar arasında bazı parametrelerin farklılık göstermesi beklenir ^17,27. Kafatası ucuna kemik çimentosu eklenmesi numuneye yükseklik katarken, uç plakaların kesilmesi yüksekliği ortadan kaldırır, en boy oranını değiştirir ve böylece sertlik gibi mekanik özellikleri değiştirir. Ayrıca, PMMA vertebral süngerimsi kemikten daha sert olmasına rağmen, PMMA'nın yer değiştirmeye uğraması mümkündür ve bu yer değiştirmenin kapsamı daha fazla karakterizasyona ihtiyaç duyar. Ek olarak, gömme yönteminden veya kesme yönteminden elde edilen sonuçların, fare omurları için sonlu elemanlar analizi kullanılarak kemik parametrelerinin tahminleriyle nasıl karşılaştırıldığı veya sonuçların farklı koşullar altında nasıl değiştiği (örneğin, düşürme hızı, farklı vertebral seviyeler, PMMA bileşimleri) açık değildir. Bununla birlikte, tüm örnekler benzer şekilde hazırlandığından, bu yöntem uygundur ve örneklerin benzer koşullar altında hazırlandığı ve test edildiği tek bir çalışmada tedavi grupları arasında karşılaştırma yapmak için kolay ve uygun maliyetli bir araç sağlar.

Basma testinden önce numune hazırlama ile ilgili olarak, numunelerin tekrarlanabilir bir şekilde hazırlanması çok önemlidir. Bu çalışmada açıklanan yöntemin olası bir sınırlaması, vertebral süreçleri ortadan kaldırmak için döner bir aletin kullanılmasıdır. Fare bel omurlarının vertebral süreçlerini ortadan kaldırmak için başka bir yöntem, daha tutarlı numune hazırlığına izin verebilecek Pendleton ve ^ark.19 tarafından tanımlanmıştır. Ayrıca, PMMA kemik çimentosu uygulamasından tutarsızlıklar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, kemik çimentosunu hacim, yerleştirme ve sertleşme süresi açısından tutarlı bir şekilde uygulamak önemlidir. Bununla birlikte, gömme yöntemi, küçük boyutları ve kırılganlıkları nedeniyle tüm numuneler arasında tutarlı bir şekilde eşit, paralel kesimler elde etmek zor olabileceğinden, kesme yöntemine kıyasla tutarlı numune hazırlama elde etmek için daha basit bir yol sağlayabilir. Gömme kullanılarak hazırlanan örneklerden elde edilen sonuçların kesinliğini değerlendirmek için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç duyulacaktır. kesme yöntemi.

Belirtildiği gibi, tek eksenli kompresyon testinden önce fare bel omurlarının numune hazırlanması için gömme yönteminin daha fazla karakterizasyonuna ve araştırılmasına ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, bu çalışma böyle bir yöntemin kullanılabileceğini göstermekte, önerilen yöntemin ayrıntılı bir tanımını sağlamakta ve yöntem kullanılarak hazırlanan örneklerden ölçülen parametrelerin tanımlayıcı istatistiklerini sunmaktadır. Bu protokol, mevcut metodolojinin mevcut olmaması nedeniyle alan için değerlidir. Ayrıca, bu yöntem diğer yöntemlere kıyasla in vivo vertebral kırıkların meydana geldiği mekanizmayı daha iyi taklit edebilir^17,27. Yöntem ayrıca, şu anda bildirilen diğer yöntemlerle ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelme avantajına sahiptir ve tek eksenli kompresyon testini kemik araştırmalarında daha uygulanabilir hale getirir. Bu özellikle önemlidir, çünkü ilaçlar, diyetler veya diğer müdahaleler kortikalden zengin kemikleri (örneğin, uzun kemik orta diyafiz) ve trabeküler açıdan zengin kemikleri (örneğin, vertebral cisimler) farklı şekilde etkileyebilir, ancak üç noktalı bükülme, kemiklerin mekanik özelliklerini değerlendirmek için baskın yöntemdir¹³. Üç noktalı bükme ve tek eksenli sıkıştırma testinin kombinasyonu, dönüştürülebilir bir üç noktalı bükme/sıkıştırma test cihazı kullanılarak daha da kolay bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, bu çalışma, aynı çalışmada hem kortikalden zengin hem de trabeküler açıdan zengin kemiğin değerlendirilmesini araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek için iki olası yol önermekte ve potansiyel olarak belirli bir tedavinin deney grupları arasında farklı kemik tiplerini nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasına yol açmaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction