Karşılaştırılabilir Kapasiteye Sahip Sıçan Kemik İliği Nötrofillerini İzole Etmek için Benzersiz Yaklaşım

Özet

Bu araştırma, sıçan kemik iliğinden bol miktarda nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) izole etmek için iki tekniği özetlemektedir. Bir yöntem, ticari bir nötrofil izolasyon kitini yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birleştirirken, diğeri yalnızca yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi kullanır. Her iki yaklaşım da periferik kan nötrofillerinden daha iyi fonksiyonel NET'ler verir.

Özet

Bu araştırmanın temel amacı, sıçan kemik iliğinden nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) izole etmek için güvenilir ve etkili bir yaklaşım geliştirmekti. Bu çaba, NET'lerin periferik kandan çıkarılmasına yönelik geleneksel yöntemle ilişkili sınırlamalar nedeniyle, esas olarak izolasyon için mevcut nötrofillerin kıtlığı nedeniyle ortaya çıkmıştır. Çalışma, kemik iliğinden sıçan nötrofilleri elde etmek için iki farklı metodoloji ortaya çıkardı: tatmin edici saflaştırma seviyeleri sağlayan aerodinamik tek aşamalı bir prosedür ve gelişmiş saflaştırma verimliliği sergileyen daha yoğun iki aşamalı bir süreç. Daha da önemlisi, her iki teknik de sıçan başına 50 ila 100 milyon arasında değişen önemli miktarda canlı nötrofil verdi. Bu verimlilik, hem insan hem de fare kaynaklarından nötrofillerin izole edilmesinden elde edilen sonuçları yansıtıyordu. Önemli bir şekilde, sıçan kemik iliğinden türetilen nötrofiller, periferik kandan elde edilen nötrofillerle karşılaştırıldığında, NET'leri salgılamak için karşılaştırılabilir yetenekler sergiledi. Bununla birlikte, kemik iliği bazlı yöntem sürekli olarak hem nötrofillerin hem de NET'lerin önemli ölçüde daha büyük miktarlarda üretildi. Bu yaklaşım, daha sonraki aşağı akış uygulamaları için bu hücresel bileşenlerden önemli ölçüde daha fazla miktarda elde etme potansiyelini göstermiştir. Özellikle, bu izole NET'ler ve nötrofiller, inflamasyon, enfeksiyon ve otoimmün hastalıklar alanlarını kapsayan bir dizi uygulama için umut vaat ediyor.

Giriş

Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynayan lökositlerin kritik bir alt kümesini oluşturur. Çeşitli proteazlar ve antimikrobiyal peptitler içeren çok loblu çekirdekler ve granüller ile karakterize edilirler¹. Nötrofiller öncelikle degranülasyon, fagositoz ve NET oluşumu yoluyla işlev görür. NET'lerin gözlemi ilk olarak 1996 yılında nötrofillerin forbol miristat asetat (PMA)² ile uyarıldığı bir deney sırasında Takei ve ark. tarafından yapılmıştır. Daha sonra, NET oluşum süreci 2004 yılında Brinkmann ve ^ark.3 tarafından "NETosis" olarak adlandırılmıştır. Araştırmalar....

Protokol

Çalışma, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından verilen bir proje lisansı (No. 20211404A) altında, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi'nin hayvanların bakımı ve kullanımı için yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Etik kurallara uygun olarak, bu çalışmada kullanılan sıçanlar, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü, 22-24 ° C'de sıcaklık ve% 50-60 nem ile kontrollü bir ortamda tutuldu. Sıçanlara yiyecek ve suya ad libitum'a erişim izni verildi. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, yaklaşık 250 g ağırlığında ve spesifik patojen içermeyen 6-8 haftalık Sprague Dawley (SD) erkek sıçanlardı. Hayvanlar ticari b....

Tartışmalar

Nötrofillerin izolasyonu, güvenilir sonuçlar elde etmek için uygun bir izolasyon yönteminin seçilmesinin çok önemli olduğu NETosis çalışmasında çok önemli bir adım oluşturur. Tartılması gereken önemli bir faktör, izolasyon sırasında lenfosit kontaminasyonunun meydana gelmesidir. Bu zorluğun ele alınması, sıçan nötrofillerini kemik iliğinden izole ederken özellikle önemlidir. Lenfositlere (1.0337-1.0765, 1.0526'da bir zirve ile) kıyasla nötrofillerin farklı yoğunluk aralığına (1.0814.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100