Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Anjiyogenez Çalışmaları için Modifiye In Vivo Matrix Jel Plug Testi
Bu Makalede
Özet
Burada sunulan yöntem, reaktiflerin anjiyogenez veya vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini in vivo boyamadan değerlendirebilir. Yöntem, neo-damarları veya vasküler sızıntıyı görselleştirmek için kuyruk damarı yoluyla dekstran-FITC enjeksiyonunu kullanır.
Özet
İn vivo anjiyogenezi araştırmak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu karmaşık ve pahalıdır, özel ekipman gerektirir veya sonraki nicel analizler için gerçekleştirilmesi zordur. Burada, in vivo anjiyogenezi değerlendirmek için modifiye edilmiş bir matris jel tıkaç testi sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktiflerin varlığında veya yokluğunda matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra deri altından alıcı farelerin arkasına enjekte edildi. 7 gün sonra, dekstran-FITC içeren fosfat tampon salin kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve 30 dakika boyunca damarlarda dolaştırılır. Matris jel tıkaçları toplanır ve doku gömme jel ile gömülür, daha sonra lekelenmeden floresan tespiti için 12 μm'lik bölümler kesilir. Bu tahlilde, yüksek moleküler ağırlığa (~ 150.000 Da) sahip dekstran-FITC, uzunluklarını tespit etmek için fonksiyonel damarları belirtmek için kullanılabilirken, düşük moleküler ağırlığa (~ 4.400 Da) sahip dekstran-FITC, neo-damarların geçirgenliğini belirtmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol in vivo anjiyogenezin kantitatif çalışması için güvenilir ve uygun bir yöntem sağlayabilir.
Giriş
Önceden var olan damarlardan neo-damarların oluşum süreci olan anjiyogenez, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümör gelişimi vb. gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte kritik bir rol oynar.1,2,3,4,5. Bu dinamik süreç, matrisin bozulması, vasküler hücre proliferasyonu, boru şeklindeki yapılar oluşturmak için göç ve kendi kendine örgütlenme ve neo-damarların stabilizasyonu dahil olmak üzere birkaç adımı içerir6. Anjiyogenezin teşvik edilmesinin miyokard enfarktüsü....
Protokol
Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wenzhou Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (XMSQ2021-0057, 19 Temmuz 2021). Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Kültür ortamının hazırlanması
- 10x M199 kültür ortamı: M199 tozunu 90 mL deiyonize su ile 10x konsantrasyona çözün ve 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin, ardından 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin. Ortamı 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
- Tam endotel kültür ortamı: 460 mL endotel hücre ortamına (ECM) 50 mL FBS, 5 mL penisilin / stre....
Temsili Sonuçlar
Şekil 1 , matris jeli, vasküler hücreler, kültür ortamı ve reaktif karışımının nasıl hazırlanacağını gösteren akış şemasıdır. Karışım daha sonra deri altından Nu / Nu farelerinin arkasına enjekte edildi ve sonunda jel tıkacı oluşturmak için pıhtılaşmasını hızlandırmak için bir ısıtma yastığı kullanılarak ısıtıldı.
Şekil 2A , floresan etiketli dekstran içeren kapları gösteren akış .......
Tartışmalar
Anjiyogenezin kantitatif değerlendirmesi için in vivo boyamadan güvenilir ve kullanışlı bir yöntem sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktifler varlığında matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra jel tıkacı oluşturmak için Nu/Nu farelerin arkasına deri altına enjekte edildi (Şekil 1). 7 günlük jel tıkacı oluşumundan sonra, dekstran-FITC intravenöz olarak enjekte edildi ve 30 dakika boyunca sirküle edild.......
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY22H020005) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81873466) tarafından finanse edilmiştir.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Referanslar
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır