İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi

Özet

Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.

Özet

Parkinson hastalığı (PH), orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybına neden olan bir dizi hücre biyolojik süreciyle bağlantılıdır. Mevcut birçok in vitro PD hücresel modeli karmaşıklıktan yoksundur ve çoklu fenotipleri hesaba katmaz. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı mDA nöronlarındaki fenotipik profilleme, PD ile ilgili bir hücre tipinde bir dizi nöronal fenotipi paralel olarak aynı anda ölçerek bu eksiklikleri giderebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen insan mDA nöronlarından fenotipik profiller elde etmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Nükleer, α-sinüklein, Tirozin hidroksilaz (TH) ve Mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) ile ilgili fenotipleri görselleştirmek için nörona özgü bir floresan boyama paneli kullanılır. Açıklanan fenotipik profilleme protokolü, 384 oyuklu plakalar, otomatik sıvı işleme ve yüksek verimli mikroskopi kullandığından ölçeklenebilir. Protokolün faydası, Lösin açısından zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) geninde PD'ye bağlı G2019S mutasyonunu taşıyan sağlıklı donör mDA nöronları ve mDA nöronları kullanılarak örneklendirilmiştir. Her iki hücre hattı da LRRK2 kinaz inhibitörü PFE-360 ile tedavi edildi ve fenotipik değişiklikler ölçüldü. Ek olarak, çok boyutlu fenotipik profillerin kümeleme veya makine öğrenimine dayalı denetimli sınıflandırma yöntemleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini gösteriyoruz. Açıklanan protokol, özellikle nöronal hastalık modellemesi üzerinde çalışan veya insan nöronlarındaki kimyasal bileşik etkilerini inceleyen araştırmacıların ilgisini çekecektir.

Giriş

Parkinson hastalığında (PH) çeşitli hücre biyolojik süreçleri bozulur. Örneğin, mitokondriyal disfonksiyon, oksidatif stres, protein yıkım kusurları, veziküler kaçakçılığın bozulması ve endolizozomal fonksiyon, orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybı ile ilişkilendirilmiştir ve PD^1'de yaygın olarak gözlenir. Bu nedenle, PH, birbiriyle etkileşime girebilen ve birbirini kötüleştirebilen çoklu hastalık mekanizmalarını içeriyor gibi görünmektedir. Bu mekanik etkileşimi araştırmanın yararlı bir yolu, kapsamlı bir fenotipik parmak izinin veya orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlarının profilinin oluşturulmasıdır.

Fenotipik profilleme, ölçülebilir özelliklerin bir koleksiyonuna dayalı olarak bir örneklem profilinin oluşturulmasını içeren bir yaklaşımdır ve ikincisi, bu profile dayalı olarak bir örneklem hakkında tahminlerde bulunmayı içerir ^2,3. Profil oluşturmanın amacı, bazıları daha önce bir hastalık veya tedavi ile ilişkilendirilmemiş olabilecek çok çeşitli özellikleri yakalamaktır³. Sonuç olarak, profil oluşturma beklenmedik biyolojik süreçleri ortaya çıkarabilir. Fenotipik profilleme tipik olarak floresan lekeli hücrelere dayanır ve fenotipik profiller oluşturmak için Hücre Boyama gibi standartlaştırılmış testler geliştirilmiştir⁴. Son zamanlarda, fenotipik profilleme, örneğin, küçük moleküllerin karakterizasyonu veya yalnızca hasta kaynaklı fibroblastlara^dayalı PD alt tiplerinin doğru tahmini için uygulanmıştır ^5,6. Bu ilerlemelere rağmen, fenotipik profilleme, LRRK2 G2019S gibi PD'ye bağlı mutasyonları eksprese eden insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi mDA nöronları gibi mitotik sonrası farklılaşmış hücrelere nadiren uygulanmıştır. iPSC'den türetilen modellerin önemli zorlukları arasında, farklılaşma grupları veya genotipler arasında ince veya değişken patolojik özelliklerin varlığı ve izole PD fenotiplerinin hastalığın tüm karmaşıklığını yakalayamaması yer alır. Ayrıca, iPSC nöronal modelleri fizyolojik olarak ilgili olsa da, teknik karmaşıklık ile ilgili endişeler nedeniyle PD ilaç keşif süreçlerinde nadiren kullanılmaktadır ^7,8.

Daha önce, hem genetik hem de kimyasal bileşik kaynaklı fenotipik değişikliklere duyarlı olan insan mDA nöronlarında PD ile ilişkili çoklu patofizyolojik fenotipleri ölçmek için sağlam bir metodoloji geliştirmiştik⁹. Bu makale, mDA nöronlarından fenotipik profiller oluşturmak için bu metodolojinin daha da optimize edilmiş bir versiyonunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır (Şekil 1). Bu protokolün, yüksek kaliteli mDA nöronlarının kullanımı ve teknik tekrarlanabilirlik gibi daha önce açıklanan fenotipik profilleme yaklaşımlarına göre çeşitli avantajları vardır. İlk kez, bu protokol, kimyasal bozulmalardan sonra fizyolojik olarak ilgili post-mitotik mDA nöronlarında fenotipik profillemeyi yüksek düzeyde ölçeklenebilir bir şekilde mümkün kılar. Tamamen farklılaşmış ve dondurularak korunmuş mDA nöronları ticari olarak temin edilebilir ve partiden partiye farklılaşma değişkenliğini önemli ölçüde azaltır. İkinci olarak, teknik değişkenlik, iyi tanımlanmış bir deneysel tasarım (yani, kültür süresi veya kenar kuyularından kaçınma), otomatik sıvı işleme ve otomatik mikroskopi kullanılarak daha da azaltılabilir. Ek olarak, denetimsiz kümeleme veya denetimli sınıflandırma yaklaşımları kullanılarak fenotipik profil analizinin ilk adımları burada özetlenmiştir ve fenotipik profilleme verilerinin nasıl analiz edilebileceğini göstermektedir. Bu protokol, genetik veya kimyasal bozulmaların neden olduğu mDA nöronlarının fenotipik değişiklikleriyle ilgilenen araştırmacılar için, özellikle yüksek düzeyde ölçeklenebilir bir çalışma kurulumu gerektiğinde, örneğin tarama kampanyaları sırasında veya daha az sayıda bileşiğin etkilerinin incelenmesi gerektiğinde, örneğin toksik etkileri belirlemek için kullanılacaktır. Özetle, insan nöronlarının fenotipik profillemesinin uygulanmasının, hastalıkla ilgili karmaşık fenotipleri incelemek ve ilaç adaylarının hücresel etkilerini karakterize etmek için değerli bir teknik olduğu tahmin edilmektedir.

Şekil 1: İnsan iPSC'den türetilen mDA nöronlarından görüntü tabanlı fenotipik profiller oluşturmak için deneysel protokolün şematik tasviri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

1. Nöron tohumlaması için besiyeri ve plakaların hazırlanması (1. Gün)

1. Plakaları Gün-1'de nöron tohumlamasına hazırlamak için, kullanmadan hemen önce Laminin'i oda sıcaklığına (RT) ısıtın. Laminin stok çözeltisini (0.1 mg / mL) soğuk PBS + / + (Ca 2 + ve Mg^{2 +} ile) 1/10 oranında seyrelterek Laminin çözeltisini hazırlayın.
   NOT: Tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Çözeltilerin ve tamponların bileşimleri Tablo 1-4'te açıklanmıştır.
2. Daha sonra, önceden kaplanmış 384 oyuklu bir Poli-D-Lizin (PDL) plakasının her bir oyuğuna 25 μL Laminin çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kaplanmış plakalar 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
   NOT: Protokol burada bir haftaya kadar duraklatılabilir. Plastik film kullanarak plakaları kapatın.
3. Komple Bakım Ortamı hazırlayın ve bir aya kadar 4 °C'de saklayın (Tablo 1).

2. Nöronların çözülmesi (Gün 0)

1. 0. Günde nöronları çözmek için, bir su banyosunu 37 °C'ye ısıtın ve Komple Bakım Ortamını ışıktan korunarak RT'ye dengeleyin.
2. Ticari olarak elde edilen donmuş nöronları içeren şişeyi ( Malzeme Tablosuna bakınız) sıvı nitrojen tankından çıkarın ve kuru buz üzerine yerleştirin. Ardından şişeyi 2 dakika boyunca su banyosuna koyun. Sıvı tamamen çözüldüğünde, şişeyi% 70 etanol ile dezenfekte edin.
3. Çözülmüş nöronları bir P1000 pipeti (yaklaşık 370 μL) ile aspire edin ve yukarı ve aşağı pipetleme olmadan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, şişeyi 630 μL Tam Bakım Ortamı ile durulayın, 50 mL'lik tüpte damla damla (45° açı) dağıtın. Dağıtırken yavaşça çalkalayın.
   NOT: Hücrelerin ozmotik yırtılmasını önlemek için ortamı yavaşça, damla damla dağıtmak çok önemlidir. 45°'lik açı ve hafif çalkalama, pipetleme sırasında yüksek lokal ozmotik basıncı en aza indirir.
4. Benzer şekilde, bir P1000 pipeti ile 50 mL santrifüj tüpüne 1 mL Tam Bakım Ortamı ekleyin. Ardından, yavaşça 2 mL Tam Bakım Ortamı ekleyin. Dağıtırken dikkatlice çalkalayın.
5. Hücreleri sayın. 10 μL Tripan Blue ve 10 μL hücre süspansiyonlu bir mikrotüp hazırlayın ve bir sayma odası lamına (10 μL) ekleyin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın) veya manuel olarak sayım yapın.
6. Saydıktan sonra, nöronları içeren 50 mL'lik tüpü RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Bir P1000 pipet ve 1 mL Tam Bakım Ortamı kullanarak peleti dikkatlice yeniden süspanse edin. Ardından istenen konsantrasyona ulaşmak için gerekli hacmi ekleyin (300.000 hücre / mL, ayrıca bir sonraki adıma bakın).

3. Hazırlanan plakalarda nöronların tohumlanması (Gün 0)

1. 0. Günde hazırlanan plakalardaki nöronları tohumlamak için, kaplanmış plakaları buzdolabından çıkarın, hücre kültürü kaputunun altına yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika boyunca RT'ye dengelenmelerini sağlayın.
2. Tohumlamadan hemen önce, otomatik bir sıvı işleyici veya 16 kanallı bir pipet ile 15 μL'lik kaplama solüsyonunu aspire edin. Kaplamanın zarar görmesini önlemek için oyuk başına yaklaşık 10 μL bırakın.
3. Daha sonra, 16 kanallı bir pipet ile oyuk başına 300.000 hücre / mL (adım 2.6'da hazırlanan) içeren 50 μL hücre çözeltisi dağıtın, bu da oyuk başına 15.000 tohumlanmış nöron ve 60 μL'lik bir nihai hacim ile sonuçlanır.
4. 384 oyuklu bir plakada, fenotipik profilleri etkileyebilecek olası kenar etkilerini en aza indirmek için sütun 1, 2, 23, 24 ve A, B, O ve P satırlarını kullanmaktan kaçının. Kullanılmayan boş kuyuları 80 μL PBS ile doldurun. Plakaları 37 °C ve %5 CO_2'de inkübe edin.

4. Orta değişim veya bileşik tedavi (3. Gün)

1. Kuyu sayısına bağlı olarak, RT'de uygun hacimde Komple Bakım Ortamını önceden ısıtın. Işıktan koruyun.
2. Orta düzeyde bir değişiklik gerekiyorsa, adım 4.4'e geçin. Bileşik işlem isteniyorsa, bileşik stok konsantrasyonunu ve kullanılan çözücüyü (su, DMSO, metanol vb.) doğrulayın.
3. Test edilecek tüm istenen konsantrasyonlar için 1.5x konsantre bileşik çözelti hazırlayın. Bileşik dilüsyonları Tam Bakım Ortamı kullanarak hazırlayın.
   NOT: Nötr bir kontrol olarak, ilgili çözücüyü test edilen bileşikle aynı konsantrasyonda kullanın. Farklı konsantrasyonlarda çoklu veya bilinmeyen bileşikler kullanılıyorsa, fenotipik profil üzerindeki çözücü etkilerini ölçmek için ayrı bir doz-yanıt deneyi yapılması tavsiye edilir.
4. Otomatik pipetleme sistemi kullanılıyorsa, 384 oyuklu bir saklama plakasına 60 μL 1,5x bileşik solüsyon ekleyin. Alternatif olarak, 16 kanallı bir pipet kullanın. Orta düzeyde bir değişiklik gerekiyorsa, bunun yerine 60 μL Tam Bakım Ortamı ekleyin.
5. Otomatik pipetleme sistemini kullanarak, 20 μL/kuyucuk tutmak için nöron içeren plakadan oyuk başına 40 μL ortamı aspire edin ve atın. Ardından, istenen nihai konsantrasyonu elde etmek için her bir oyuğa 384 oyuklu saklama plakasından 40 μL/kuyucuk 1.5x bileşik çözelti ekleyin.
   NOT: Tam ortam değişiklikleri yapmamak, ancak nöronal halıya veya kaplamaya zarar vermemek için her zaman kuyuda artık ortam bırakmak çok önemlidir.
6. Nöronal kültürün bu protokolde tarif edilen 6 günden fazla yapılması durumunda, ortamı 2-3 günde bir değiştirin.

5. Nöron fiksasyonu ve boyanması (6-7. günler)

1. Nöronları 6. ve 7. günlerde sabitlemek ve boyamak için, tüm dağıtım ve yıkama adımları için otomatik bir sıvı işleyici kullanın. Alternatif olarak, 16 kanallı bir pipet kullanın.
2. Triton X-100'ü 1x PBS'de seyrelterek %10'luk bir Triton X-100 çözeltisi hazırlayın. Çözelti homojen olana kadar girdap. 4 °C'de saklayın.
3. Nöronları sabitlemek için, %4'lük bir nihai konsantrasyonla sonuçlanan 20 μL/kuyu %16 PFA dağıtın. Plakayı RT'de 30 dakika inkübe edin ve 1x PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 20 μL/kuyu PBS bırakın.
   DİKKAT: PFA, oral, dermal ve solunum toksisitesine neden olduğu bilinen tehlikeli bir madde olarak kabul edilmektedir. Aynı zamanda gözler için bir tehdit oluşturur ve genetik mutasyonlara ve kansere yol açabilir. PFA'nın uygun şekilde kullanılması, uygun havalandırmanın sağlanmasına ek olarak göz ve yüz koruması gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanların kullanılmasını gerektirir. PFA'nın çevreye salınmasını önlemek önemlidir.
4. Geçirgenlik ve blokaj için 2x blokaj solüsyonu hazırlayın (Tablo 2).
5. 20 μL / kuyucuk 2x bloke edici çözelti (1x nihai konsantrasyon) ekleyin, RT'de 1 saat inkübe edin ve PBS ile bir kez yıkayın. Yıkadıktan sonra 20 μL/kuyu PBS tutun.
6. Primer antikor (bakınız Malzeme Tablosu) boyama için, 2x primer boyama tamponu hazırlayın (Tablo 3).
7. 20 μL/kuyucuk 2x birincil boyama tamponu (1x nihai konsantrasyon) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ertesi sabah 7. günde, PBS ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra 20 μL/kuyu PBS bırakın.
8. İkincil antikor (bkz . Malzeme Tablosu) boyama için, 2x ikincil boyama tamponu hazırlayın (Tablo 4).
9. 20 μL / kuyucuk 2x ikincil boyama tamponu (1x nihai konsantrasyon) ekleyin, RT'de ışıktan uzakta 2 saat inkübe edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 100 μL PBS / kuyu bırakın.
   1. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakaya alüminyum sızdırmazlık ekleyin. Alternatif olarak, plakayı plastik film ve alüminyum folyo kullanarak örtün. Görüntü almaya devam edin veya plakayı 4 °C'de saklayın.
      NOT: Protokol burada bir haftaya kadar duraklatılabilir. Arka planda floresan gözlenirse, engelleme süresini artırmayı düşünün. Boyama yetersizse, birincil antikor konsantrasyonunu veya inkübasyon süresini artırmayı deneyin.

6. Floresan lekeli nöronların görüntülenmesi (7. Gün)

1. 7. Günde kaplanmış, kültürlenmiş ve boyanmış nöronların görüntülerini elde edin. İdeal olarak, otomatik bir konfokal floresan mikroskobu kullanın (bkz. Alternatif olarak, görüntüleri manuel olarak alın.
2. Sırasıyla 405 nm, 488 nm, 561 nm ve 647 nm lazerler kullanarak Hoechst, TH, α-sinüklein ve MAP2 kanallarını elde edin (Şekil 2).
   NOT: Fenotipik profilleme için yeterli miktarda ayrıntılı veri oluşturmak için 40x'lik bir objektif kullanın ve 2 μm ile ayrılmış 3 Z diliminden oluşan Z yığınlarını kullanarak 16 alan/kuyu elde edin. Nöronal halıda pipetlemeye bağlı hasarlar varsa, bu alanları görüntülemekten kaçınmaya çalışın.
3. Mikroskoba ve kameraya bağlı olarak, floresan yoğunluklarının optimum dinamik aralığını elde etmek için dört floresan kanalının her biri için pozlama sürelerini ve uyarma yoğunluklarını ayrı ayrı ayarlayın.
   NOT: Görüntüleme yazılımı, ideal pozlama süresini belirlemek için genellikle bir histogram sağlar. Histogram düşük sinyal aralığında çok fazla sola kaydırılırsa, pozlama süresi çok kısadır veya uyarma yoğunluğu çok düşüktür. Sağdaki maksimum sinyal seviyesinde keskin bir uçurum varsa, sinyal değeri doymuştur. Bu durumda, uyarma yoğunluğunu azaltın veya maruz kalma süresini kısaltın.
4. Görüntüleri .tif gibi kayıpsız ve açık bir biçimde saklayın.

7. Görüntü işleme (Gün 8)

1. Kantitatif fenotipik profillerin oluşturulması için görüntü segmentasyonu ve fenotipik özellik çıkarımı gereklidir. Görüntü segmentasyonu ve özellik çıkarma için PhenoLink yazılımını kullanın (Malzeme Tablosu). PhenoLink'i yükleme talimatları GitHub deposunda (https://github.com/Ksilink/PhenoLink) bulunabilir.
   NOT: Görüntü segmentasyonu, bir görüntüdeki farklı nesneleri veya bölgeleri tanımlamak ve ayırmak için kullanılırken, fenotipik özellik çıkarımı, bu bölgelerden ilgili bilgileri analiz etmek ve çıkarmak için kullanılır. Çok kanallı floresan görüntülerden nicel bilgileri çıkarmak için CellProfiler 10, ImageJ/FIJI 11, Napari¹² veya Knime Analytics Platform¹³ gibi çeşitli alternatif yazılım çözümleri mevcuttur.
2. Aydınlatma düzeltmeli ham görüntülerde görüntü segmentasyonu gerçekleştirin. Arka plan sinyalinin minimum olması ve istenen segmentli sinyalin ham görüntüdeki sinyale karşılık gelmesi için plaka başına ilgili floresan kanal yoğunluğu eşiklerini ampirik olarak belirleyin. Aynı gün işlenen ve boyanan plakalar tipik olarak segmentasyon için karşılaştırılabilir kanal yoğunluğu eşikleri gerektirir.
3. Canlıları ölü hücrelerden ayırmak için çekirdek boyutunu ve yoğunluğunu tanımlayın. 40x görüntü kullanırken, diğer tüm varsayılan parametreleri koruyun ve yazılımı çalıştırın. Kuyu başına yüz yirmi altı nicel görüntü özelliği hesaplanacaktır (Ek Tablo 1).
4. Fenotipik profiller oluşturmak ve farklı hücre hatlarından veya tedavi koşullarından fenotipik profilleri karşılaştırmak için elde edilen tablo nicel verileri kullanın. Her satır biyolojik bir duruma (kuyuya) karşılık gelir ve her sütun belirlenmiş bir fenotipik özelliğe karşılık gelir.
   NOT: Kullanımını göstermek için veri analizi boru hattıyla birlikte örnek bir çıktı dosyası sunuyoruz (bkz. Ek olarak, Şekil 3 , fenotipik bir profilin bileşimini göstermektedir.

8. Fenotipik profil oluşturma ve görselleştirme (8. Gün)

1. Bilgisayarınızda Python ve Jupyter yüklü değilse, Anaconda Dağıtımını kurun ve Jupyter yazılımını açın. Sağlanan Jupyter not defterini ve sağlanan diğer tüm dosyaları indirin ve bunları aynı dizine kaydedin (bkz. Jupyter yazılımını kullanarak Jupyter not defteri dosyasını açın.
   NOT: Anaconda, Python gibi programlama dilleri için ücretsiz ve açık kaynaklı bir platformdur. Bu platform, fenotipik profiller (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling) oluşturmak ve analiz etmek için sağlanan Jupyter not defterini yürütebilen Python yorumlayıcısı Jupyter ile birlikte gelir.
2. Jupyter yazılımını kullanarak Jupyter not defterini hücre hücre yürütün. Sağlanan örnek veriler .fth ve dosya .txt gereksinimlerinin Jupyter not defteri ile aynı dizinde bulunması gerekir. Her Jupyter not defteri hücresine, işlevselliğini açıklamak için açıklama eklenir.
   NOT: Jupyter notebook'u veri yükleme ve ölçeklendirme ile başlayarak doğru sırayla kullanmak ve sonuna kadar hücre hücre ilerlemek çok önemlidir. Tüm veriler ve grafik çıktısı, Jupyter not defteri kaynak dizininde yeni oluşturulan bir klasörde depolanır. Şekil 4'te iş akışı ve iş akışı çıktısı gösterilmektedir.

Sonuçlar

mDA nöronlarında fenotipik profilleme, hücresel biyolojinin birçok yönünü ve deneysel modülasyon sırasındaki değişikliklerini ölçmenin etkili bir yoludur. Bu metodolojiyi örneklemek için, bu çalışmada kriyoprezervasyonlu LRRK2 G2019S ve sağlıklı donör mDA nöronları kullanılmıştır. Bu nöronlar yaklaşık 37 gündür farklılaşmıştır, post-mitotik ve eksprese nöronal belirteçlerdir (TUBB3 ve MAP2) ve FOXA2 ile kombinasyon halinde tirozin hidroksilaz (TH) dahil olmak üzere dopaminerjik n...

Tartışmalar

Fenotipik profilleme, floresan boyama, mikroskopi ve görüntü analizi uygulayarak hücrelerdeki çok sayıda fenotipi ölçmek için kullanılan bir tekniktir³. Fenotipik profiller, hücresel biyolojide tek bir okuma kullanıldığında fark edilmeyebilecek karmaşık değişiklikleri anlamak için hücre hatları veya diğer deneysel koşullar arasında elde edilebilir ve karşılaştırılabilir. Burada, PD hücresel biyolojisini modellemek için sıklıkla kullanılan bir hücre tipi olan ins...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.