Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Özet

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanılarak yapılan konvansiyonel kemik rejenerasyon tedavisinin, anjiyogenezi indükleyecek bir mekanizmaya sahip olmadığı için kritik boyuttan daha büyük kemik defektlerine uygulanması zordur. MSC'lerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesi, endokondral ossifikasyon (ECO) yoluyla in vivo anjiyogenez ve kemik oluşumunu indükler. Bu nedenle, bu EKO aracılı yaklaşım gelecekte umut verici bir kemik rejenerasyon tedavisi olabilir. Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulamasının önemli bir yönü, kemik defektini onarmak için implante edilecek yeterli kıkırdağın hazırlanması için bir protokol oluşturmaktır. Gerçek kemik defektinin şekline uyan boyutta tek bir greftli kıkırdak kütlesi tasarlamak özellikle pratik değildir. Bu nedenle, nakledilecek kıkırdak, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturma özelliğine sahip olmalıdır. Hidrojeller, klinik gereksinimleri karşılamak için endokondral kemikleşme için doku mühendisliği greftlerini büyütmek için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro olarak MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo olarak ECO'yu desteklese de, klinik uygulamaların ihtiyaçlarını karşılamak için en uygun iskele malzemesi henüz belirlenmemiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak hücre dışı matrisinin çok önemli bir bileşenidir ve biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. Burada, HA hidrojellerinin, MSC bazlı kıkırdak dokusunun in vitro farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel özelliklere sahip olduğunu gösteriyoruz.

Giriş

Otolog kemik, travma, konjenital defektler ve cerrahi rezeksiyona bağlı kemik defektlerinin onarımında hala altın standarttır. Bununla birlikte, otojen kemik greftinin donör ağrısı, enfeksiyon riski ve hastalardan izole edilebilecek sınırlı kemik hacmi gibi önemli sınırlamaları vardır 1,2,3,4. Doğal veya sentetik polimerleri kalsiyum fosfat veya hidroksiapatit ^5,6 gibi mineralize malzemelerle birleştiren kemik ikameleri olarak çok sayıda biyomalzeme geliştirilmiştir. Bu mühendislik m....

Protokol

Bu protokolde 4 haftalık çıplak erkek fareler kullanılır. Dört fareyi 22−24 °C ve %50−%70 bağıl nemde 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında bir kafeste barındırın. Tüm hayvan deneyleri, Tokyo Tıp ve Diş Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (onay kimliği: A2019-204C, A2020-116A ve A2021-121A).

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. MSC büyüme ortamının ek kitini MSC bazal ortamına ekleyerek mezenkimal kök hücre büyüme ortamını (MSC büyüme ortamı) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
2. Ortama %10 fetal sığır serum....

Tartışmalar

Hipertrofik kıkırdaktan kemiğe geçişi destekleyen uygun iskele materyallerinin kullanılması, MSC bazlı tasarlanmış hipertrofik kıkırdak greftlerini büyütmek ve klinik olarak anlamlı boyuttaki kemik kusurlarını tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, HA'nın in vitro olarak MSC bazlı hipertrofik kıkırdak dokusunun farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel bir iskele materyali olduğunu gösteriyoruz

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332