Metagenomik Amplikon Dizileme Kullanılarak Şarap Üretimi Sırasında Fermente Traminette Üzümlerinin Bakteri Topluluğunun Profillenmesi

Özet

Burada, Traminette üzümlerinin, fermente üzümlerin ve nihai şarabın bakteri topluluğunu belirlemek için amplikon metagenomiğini tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Dizileme teknolojisindeki ilerlemeler ve mikrobiyal topluluk yapılarının profilini çıkarmak için biyoinformatik araçların kullanımına nispeten kolay erişim, üzüm ve şarapta hem kültürlenebilir hem de kültürlenemeyen mikropların daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmıştır. Endüstriyel fermantasyon sırasında, bilinen ve bilinmeyen mikroplar genellikle ürün geliştirme ve tatsızlıktan sorumludur. Bu nedenle, üzümden şaraba kadar bakterilerin profillenmesi, in situ mikrobiyal dinamiklerin kolay anlaşılmasını sağlayabilir. Bu çalışmada, Traminette üzümlerinin bakterileri fermantasyona tabi tutulmalı ve nihai şarap, 15 ng/μL ila 87 ng/μL veren DNA ekstraksiyonuna tabi tutulmuştur. V4 bölgesinin hiperdeğişken bölgesinin 16S amplikonu, filum Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota'dan oluşan nispeten bol bakteri ve ardından Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota ve Acidobacteriota'dan oluşan nispeten bol bakteriler dizilendi. Paylaşılan benzersiz operasyonel taksonomik birimlerin (OTU) bir Venn şeması analizi, 15 bakteri filumunun hem üzüm şırası, hem fermantasyon aşaması hem de son şarap için ortak olduğunu ortaya koydu. Daha önce bildirilmeyen filumlar, 16S amplikon diziliminin yanı sıra Enterobacteriaceae ve Lactobacillaceae gibi cinsler kullanılarak tespit edildi. Şarapta organik besin kullanımındaki varyasyon ve bunun bakteriler üzerindeki etkisi test edildi; Fermaid O içeren Traminette R tankı ve Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O ile uyarılan Traminette L . Kruskal-Wallis testi kullanılarak alfa çeşitliliği düzgünlük derecesini belirledi. Beta çeşitliliği, iki işlem için fermantasyon aşamasında bakterilerde bir kayma olduğunu gösterdi ve son şarap bakterileri benzer görünüyordu. Çalışma, şarap üretimi sırasında üzüm bakterilerinin kalitesini ve daha iyi kullanımını desteklemek için şarap üretimi sırasında bakteri değişikliklerini izlemek için 16S amplikon diziliminin kullanılabileceğini doğruladı.

Giriş

Traminette üzümü, kayda değer verim ve çeşitli mantar enfeksiyonlarına karşı kısmi dirence ek olarak üstün şarap kalitesi üretimi ile karakterize edilir ^1,2,3. Üzümlerin doğal fermantasyonu, ilişkili mikroorganizmalara, şarap üretim ortamına ve fermantasyon kaplarına^{dayanır 4,5}. Çoğu zaman, birçok şarap imalathanesi fermantasyon, alkol üretimi, esterler, aroma ve lezzet gelişimi için yabani maya ve bakterilere güvenir⁶.

Bu çalışmanın amacı, üzümlerin bakteri bileşimini incelemek ve fermantasyon sırasındaki dinamiklerini izlemektir. Bununla birlikte, alkolün üretildiği birincil fermantasyon için Saccharomyces cerevisiae gibi başlangıç kültürlerinin modern kullanımı, farklı şarap stillerinde ortaktır⁷. Ek olarak, malik asidin Oenococcus oeni tarafından laktik aside dekarboksilatlandığı ikincil fermantasyon, şarabın organoleptik ve tat profilini iyileştirir ve şarabın asitliğini azaltır ^8,9. Kültürden bağımsız yöntemlerin kullanımındaki son gelişmelerle birlikte, şaraplık üzüm ve şıraya aktarılan ve son ürüne kadar farklı zamanlarda fermantasyona katılan türlerle ilişkili farklı mikropları belirlemek artık mümkündür¹⁰.

Şarap fermantasyonu sırasında şıraya aktarılan farklı üzümlerden elde edilen yabani bakterilerin rolleri ve dinamikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu bakterilerin çoğunun taksonomisi bile bilinmemektedir veya fenotipik özellikleri karakterize edilmemiştir. Bu, kokültür fermantasyonundaki uygulamalarının hala yeterince kullanılmamasına neden olur. Bununla birlikte, üzüm ve şarapla ilişkili bakteri popülasyonunu belirlemek için mikrobiyolojik kültüre dayalı analizler kullanılmıştır¹⁰. Seçici kültür kaplamasının sıkıcı olduğu, kontaminasyona eğilimli olduğu, düşük tekrarlanabilirliğe sahip olduğu ve çıktının şüpheli olabileceği yaygın olarak bilinmektedir; Ayrıca büyüme gereksinimleri bilinmeyen bakteri türlerini de özlüyor. Önceki çalışmalar, kültürden bağımsız, 16S rRNA gen tabanlı metodolojilerin, karmaşık mikrobiyal toplulukları karakterize etmek için daha güvenilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunduğunu göstermektedir¹¹. Örneğin, 16S rRNA geninin hiperdeğişken bölgelerinin dizilenmesi, üzüm yaprakları, meyveler ve şaraptaki bakterileri incelemek için başarıyla kullanılmıştır 12,13,14. Çalışmalar, 16S rRNA metabarkodlama veya tüm metagenomik dizileme kullanımının mikrobiyom çalışmaları için uygun olduğunu göstermiştir¹⁵. Şarap üretimi sırasında bakteri çeşitliliğinin metabolik özellikleriyle olası bağlantısı hakkında ortaya çıkan bilgiler vardır, bu da şarapolojik özelliklerin ve terörün belirlenmesine yardımcı olabilir¹⁶.

Üzüm ve şarap mikrobiyal ekolojisini incelemek için yeni nesil dizileme (NGS) kullanan metagenomik araçların avantajlarını en üst düzeye çıkarma ihtiyacı vurgulanmıştır^16,17. Ayrıca, gıda ve fermantasyon ekosisteminin mikrobiyal çeşitliliğinin profilini çıkarmak için yüksek verimli dizilemeye dayalı kültürden bağımsız yöntemlerin kullanılması, birçok laboratuvar için çok alakalı ve değerli hale gelmiştir ve endüstriyel kullanım için önerilmektedir^18,19. Mevcut mikrobiyal popülasyonların tespiti ve taksonomik profillemesi ve çevresel mikropların katkısı, nispi bollukları ve alfa ve beta çeşitliliği²⁰ için bir avantaj sağlar. 16S bölgesinin değişken bölgesinin dizilimi, tercih edilen önemli bir gen haline gelmiştir ve farklı mikrobiyal ekolojik çalışmalar sırasında kullanılmıştır.

Birçok çalışma, şarap^{fermantasyonu sırasında} mantarlara, özellikle mayalara odaklanırken, bu çalışma, şarap üretimi için Traminette üzümlerinin fermantasyonu sırasında bakterileri incelemek için kullanılan 16S amplikon dizilimi ve biyoinformatik araçları bildirmiştir.

Protokol

1. Deneysel şarap üretimi

1. Jonesville, Kuzey Carolina bağındaki Dynamis Estate şarabından Traminnette üzümleri elde edin, kökünü çıkarın ve şırayı iki ayrı 600 L'lik üstü açık fermentöre bırakmak için ezin ve kapakları kapalı olarak yaklaşık 4 gün kabukları üzerinde bırakın.
2. Derileri ıslak tutmak ve uçucu asit (VA) üretimini sınırlamak için kapakları günde bir kez yumruklayın.
   NOT: Buradaki fikir, aromatik öncülerin (monoterpenlerin) çoğunun kabuklarda yer alması ve şarabın aromatik potansiyelini artırmak için meyve suyunu deri ile temas halinde bırakmasıdır.
3. 4 gün sonra, Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand) atın. Bu maya, güçlü bir fermentör olduğu ve üzümlerden elde edilen şaraptaki çeşit karakterini arttırmakla ilişkili olduğu için seçilmiştir.
4. Bir tankta, Traminette R, fermantasyon güvenliğini sağlamak için briks 17.7 ve 20 g/hL Fermaid O ve 13.1 g/hL'de 12.5 g/hL Fermaid K iken 20 g/hL Fermaid O ve 12.5 g/hL Fermaid K ekleyin, diğer tank Traminette L, briks 17.1'deyken 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc ekleyin. Ayrıca şarabın çeşitli karakterini arttırmak için briks 13.4'teyken 20 g/hL Fermaid O ekleyin.
5. Şıra (1. gün), maya eklenmiş (4. gün), fermente şıra (15. gün) ve bitmiş şarap örnekleri (30. gün) kopya örnekleri alın ve DNA ekstraksiyonu ve metagenomik analizden önce -20 ° C'de tutun.

2. Metagenomik için DNA ekstraksiyonu

1. Yukarıda elde edilen tüm kopya numuneleri ilk santrifüjlemeye kadar buz üzerinde tutun.
2. Fermente edilmiş numunenin 20 mL'sini steril 50 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın.
3. 10 mL soğuk su ekleyin ve homojenize edin (vorteks). 4 ° C'de 800 x g'de 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
   NOT: Bu adım, numunenin katılarını çıkaracaktır.
4. Adım 2.3'ü iki kez tekrarlayın ve süpernatantları aynı tüpte toplayın.
5. Hücreleri peletlemek için süpernatanı 4 ° C'de 3.000 x g'de 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
6. Peleti 1 mL PBS içinde yeniden süspanse edin, 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve 2 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin. PBS kullanarak iki yıkama daha yapın.
7. Bu adımda, peletleri -20°C'de dondurun veya 2.8 adımını izleyin. Tüm numunelerin aynı şekilde işlenmesi önemlidir.
8. 978 μL sodyum fosfat tamponu ekleyin. Sodyum fosfat tamponu hazırlayın, 3.1 g NaH₂PO₄ · _H2Ove 10.9 g_Na2HPO4(susuz) damıtılmış_H2O'ya1 L'lik bir hacim yapmak ve pH'ı 7.4'e ayarlayın.
9. 122 μL DNA tamponu (DNA döndürme kiti) ve vorteks ekleyin.
10. Buzdolabında (4 °C) 45 dk-1 saat bekletin. Numuneleri her 15 dakikada bir vorteksleyin. Bu adım, gece boyunca (o/n) veya DNA spin kitini kullanmaya devam etmeye hazır olana kadar bırakılabilir.
11. 1 mL numuneyi bir Lizis çözeltisi 1 tüpüne (DNA sıkma kiti) aktarın ve kapağı sıkın (numune numarasını kapağın üzerine değil, tüpün yan tarafına yazın; kit reaktifleri kapağın üzerinde yazılı olan her şeyi çıkaracaktır).
12. Numuneyi boncuk çırpıcı bir öğütücüde (6,5 m/s, CY: 24 x 2) 60 saniye boyunca üç kez homojenize edin. Boncuk çırpıcı öğütücü buz koyacak cihaza sahipse, tüplerin altına 50 g kuru buz koyun. Değilse, numuneleri her homojenizasyon adımı arasında 5 dakika ıslak buz üzerinde tutun.
13. Lizing Matrix E tüplerini (DNA sıkma kiti) 16800 x g'de (veya maksimum hızda) 1 dakika santrifüjleyin.
14. Süpernatanı temiz bir mikrotüpe aktarın. Daha sonra 250 μL protein çökeltme çözeltisi (PPS) reaktifi (DNA sıkma kiti) ekleyin ve tüpü elle 10 kez çalkalayarak karıştırın.
15. Çökeltiyi peletlemek için 16800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
16. Süpernatanı steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Süpernatanıma 1 mL bağlayıcı matris süspansiyonu (DNA spin kiti) ekleyin.
    NOT: Bağlayıcı matris süspansiyonunu kullanmadan önce homojen olana kadar yeniden askıya alın.
17. Tüpleri elle 2 dakika ters çevirin, ardından tüpleri 3 dakika boyunca bir rafta bekletin (silika matrisinin yerleşmesine izin vermek için).
18. Süpernatanın 1 mL'sini dikkatlice çıkarın. Kalan süpernatanttaki matrisi yeniden askıya alın.
19. Karışımın 600 μL'sini bir spin filtre tüpüne (DNA spin kiti) aktarın ve 14500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
20. Kalan karışımı ve santrifüjü ekleyin.
21. Akışı boşaltın ve spin filtre tüpüne 500 μL yıkama solüsyonu (DNA spin kiti) ekleyin ve 14500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin (yıkama solüsyonuna EtOH eklediğinizden emin olun; ürün el kitabına bakın). Akışı boşaltın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama).
22. Akışı boşaltın ve artık yıkama çözeltisi matrisini kurutmak için 14.500 x g'da 2 dakika daha santrifüjleyin.
23. Döndürme filtresini çıkarın ve yeni bir yakalama tüpüne (DNA döndürme kiti) yerleştirin. Sıkma filtresini oda sıcaklığında (RT) 5 dakika havayla kurutun.
24. DNAse içermeyen suyu (DNA sıkma kiti) 55 °C'de 5 dakika ısıtın. 50 μL DNAse-free su ekleyin ve DNA'nın verimli bir şekilde elüsyonu için filtre membranı üzerindeki matrisi bir pipet ucuyla hafifçe karıştırın. Numunelerin RT'de 1 dakika bekletilmesine izin verin, ardından DNA'yı elüte etmek için 14500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
25. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin. Numune karışımını (2 μL numune + 2 μL su + 1 μL yükleme tamponu) bir jele yükleyin. DNA konsantrasyonunu ölçün.
26. Numuneleri -20 °C'de saklayın.
27. Ekstrakte edilen DNA'yı ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.
    NOT: 1 μL'lik bir DNA hacmi düşürüldü ve ölçüldü ve DNA'nın kalitesi A260 / A280 oranında kaydedildi.

3. DNA elektroforezi

1. 0.5 Tris/Borat/EDTA (TBE) tamponunda (mini jel için 20 mL, orta jel için 70-100 mL) %1 agaroz jel hazırlayın. Agaroz + tamponu tartın, agarozu eritmek için mikrodalgada kaynatın, tekrar tartın ve orijinal ağırlığına dH₂O ekleyin. Agaroz çözeltisini 55-60 °C'ye soğutun ve tarak tertibatlı jel kalıbına dökün. Jeli katılaşmaya bırakın.
2. Numuneye 1 μL 10x jel yükleme tamponu ekleyin (10 μL) ve bir moleküler ağırlık işaretleyicisinin yanındaki jele yükleyin. Mavi boya dibe yakın olana kadar 100-115 V (büyük jel) veya 90 V (mini jel) sıcaklıkta negatiften (siyah) pozitife (kırmızı) çalıştırın.
3. Jeli 1 μL/mL etidyum bromür veya SYBR yeşili (nitril eldiven ve gözlük gereklidir) içinde 30 dakika lekeleyin, suyla durulayın ve view ultraviyole (UV) ışık kaynağı altında. Yinelenen numunelerden, daha sonraki işlemler için en yüksek verimi seçin.

4. Yüksek verimli sıralama

1. Spesifik primerler 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') ve 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')²² kullanarak 16S rRNA geninin V4 hiperdeğişken bölgesini amplifiye edin. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) koşullarını 2 dakika boyunca 94 °C'de, 20 saniye boyunca 30 döngü 94 °C'de, 20 saniye boyunca 58 °C'de, 1 dakika boyunca 65 °C'de ve 10 dakika boyunca 65 °C'ye ayarlayın (son uzatma).
2. PCR reaksiyonlarını yüksek kaliteli bir PCR ana karışımı ile gerçekleştirin (Malzeme Tablosu).
3. DNA kitaplığı hazırlama kiti ile kitaplıklar oluşturun ve ardından bir dizileme platformunda eşleştirilmiş uç dizileme kullanarak dizileme yapın.
   NOT: Burada, NEBNext Ultra II DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti ile oluşturulan kütüphaneler, novaseq6000 platformunda eşleştirilmiş uçlu Illumina dizilemesi (2 × 250 bp) kullanılarak dizilenmiştir.
4. Sıralama adımlarını izleyin:
   1. Adım 1: DNA'yı bir enzimle, genellikle genel bir boyut seçen bir yöntemle kesin.
      1. 25 μL DNA'ya (yaklaşık 1 μg) 3,5 μL dizileme tamponu ve 1,5 μL enzim karışımı ekleyin, bir pipetle 10 kez karıştırın ve hızlıca döndürün.
      2. Aşağıdaki koşullara sahip bir termodöngüleyiciye yerleştirin: kapağı 75°C'de önceden ısıtın, (1) 20 °C için 30 dakika (2) 65 °C için 30 dakika (3) 4°C'de tutun.
   2. 2. Adım: Ligasyon yoluyla bağdaştırıcılar ekleyin
      1. Bir pipet ile 15 μL ligasyon ana karışımı, 1,25 μL adaptör, 0,5 μL ligasyon arttırıcı ve 30 μL son hazırlık DNA karışımı ekleyin.
      2. Bir termosiklerde 20 °C'de 15 dakika inkübe edin ve ardından toplam 48.26 μL elde etmek için ligasyon karışımına 1.5 μL urasil-spesifik eksizyon reaktifi (USER) enzimi ekleyin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      3. Adaptör ligasyon DNA'sına 43,5 μL manyetik boncuk ekleyin, bir pipetle 20 kez karıştırın ve RT'de 5 dakika inkübe edin. Boncukları manyetik bir rafla ayırın, ardından 5-10 dakika inkübe edin ve süpernatanı atın.
      4. Peleti 100 μL %80 etanol ile yıkayın, 30 saniye kurutun ve tekrar yıkayın. Boncukları ve peletleri 8,5 μL'lik 10 mM Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H₂0'da elute edin, bir pipetle karıştırın ve RT'de 2 dakika inkübe edin.
      5. Manyetik rafta inkübe edin ve süpernatan olarak 7.5 μL ayrıştırılmış DNA'yı çıkarın. Elute'u yeni bir tüpe yerleştirin ve bir PCR adımı gerçekleştirin.
      6. İlk olarak, 25 μL PCR reaksiyon karışımı elde etmek için 7,5 μL adaptörle bağlanmış DNA'ya 12,5 μL ana karışım, 2,5 μL indeks primer i7 primer ve 2,5 μL evrensel PCR primer/i5 primer ekleyin. Aşağıdaki PCR koşulunu kullanın: kapağı önceden 103 °C'ye ısıtın. 98 saniye boyunca 30 °C, 98 saniye boyunca 10 °C, 65 saniye boyunca 75 °C, 65 dakika boyunca 5 °C ve 4 döngüden sonra 10 °C'de tutun.
      7. 25 μL amplifiye DNA'yı temizleyin. 22,5 μL manyetik boncuk ekleyin ve 20 kez karıştırın. RT'de 5 dakika inkübe edin ve süpernatanın 50 μL'sini çıkarın. Boncukları 100 μL %80 etanol ile yıkayın ve boncukları 30 saniye boyunca nazikçe kurutarak tüm etanolü çıkarın.
      8. Koyu kahverengi boncukları 16 μL suda tekrar süspanse edin, bir pipetle 20 kez karıştırın ve 30-60 saniye manyetik rafa koyun. 15 μL'yi yeni bir tüpe aktarın.
      9. Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin. 90 μL tampon + 1 μL boya + 2 μL DNA kütüphanesi örneğini karıştırın ve konsantrasyonu okuyun. DNA'yı 2 nM'ye seyreltin, akış hücresine 27-30 μL yükleyin ve sıralayıcıya yerleştirin.
   3. Adım 3: Adaptörleri sıralayın, yukarıda oluşturulan kitaplıkları desenli akış hücresinin matrisine hibritleştirin ve üreticinin talimatlarına göre DNA'yı yakalayın. İkinci sentez için şablon olarak kullanın.
      1. Ardından, ikinci ipliği bir klonal kümeye yükseltin. Kümeyi doğrusallaştırın ve etkin siteleri engelleyin. Üreticinin protokolüne göre dizide sentez yoluyla dizileme için bir alan sağlamak için sıralama astarı ekleyin.
         NOT: Kimyasal olarak, modifiye edilmiş nükleotidler, doğal tamamlayıcılık kullanarak DNA şablon zincirine bağlanır. Her nükleotidin bir floresan etiketi ve bir sonraki bazın dahil edilmesini engelleyen tersine çevrilebilir bir sonlandırıcısı vardır. Bu nedenle, bir floresan sinyalinin varlığı, hangi nükleotidin yerleştirildiğini gösterir ve sonlandırıcı, bir sonraki bazın bağlanması için bölünür.
   4. Adım 4: Sentez yoluyla art arda sıralanan dizi kümeleri vermek için tek bağlı ipliği güçlendirin.
      NOT: Kümeler, çift yönlü tarama ve iki kanallı dizileme kimyası yoluyla tek bir iplikten daha parlak bir sinyal verir. Sıralama yazılımı, temel çağrı (*.cbcl) dosyalarını veri analizi için belirtilen çıktı klasörü konumuna otomatik olarak aktarır.

5. Biyoinformatik

1. Dizi verilerini FASTQ dosyaları olarak oluşturun. Aşağıdaki bölümleri içerecek şekilde analiz edin.
   1. Bölüm I:
      1. Sıralayıcıdan alınan FASTQ dosyalarını kaydedin, bir elektronik tablo dosyası açmak için tıklayın ve eşleme/meta veri dosyaları oluşturun.
      2. Nephele web sitesini (https://nephele.niaid.nih.gov/) açın, FASTQ dosyalarını yükleyin, QIIME2^22'de QC, filtreleme ve kırpmayı okuyun. Ham dizileri dizi okuma arşivi (SRA) ve GenBank olarak NCBI BioProject'te (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/) saklayın
   2. Bölüm II: Nephele web sitesine (https://nephele.niaid.nih.gov/) gidin, çoğullamadan arındırılmış eşleştirilmiş uç okumaları, filtre değiştirme ve kimera hatalarını yapın ve DADA2²³ kullanarak birleştirin. %97 benzerlikte bakteri taksonomik ataması gerçekleştirmek için Silva sürüm 132 %99 OTU veritabanında eğitilmiş Naive Bayes sınıflandırıcısını kullanın²⁴.
   3. Bölüm III: MicrobiomeDB web sitesini açın, dosyaları yüklemek için tıklayın ve OTU alfa çeşitliliği, beta çeşitliliği, göreceli bolluk ve seyrekleşme eğrileri (https://microbiomedb.org/mbio/app) oluşturun.
   4. Bölüm IV: Isı haritaları, Venn diyagramları ve doğrusal diskriminant analizi efekt boyutu (https://microbiomedb.org/mbio/app) yapmak için bir elektronik tablo açın ve verileri aktarın.

6. İstatistiksel analiz

1. QIIME2^22'yi açın ve alfa-grup-önem komut dosyasını kullanarak gruplar arasındaki alfa çeşitliliğindeki önemli farklılıkları belirleyin. Bu aynı zamanda Kruskal-Wallis testini de gerçekleştirecektir.
2. İkili bir test²⁵ de dahil olmak üzere PERMANOVA kullanarak gruplar arasındaki beta çeşitliliğindeki farklılıkları belirleyin.
3. MicrobiomeDB kullanan gruplar arasında bakteri topluluk yapısındaki önemli farklılıkları elde edin. p değerinin ≤0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Üzüm şırasından elde edilen DNA'nın miktarı ve kalitesi, fermente şarap ve nihai şarap ilk olarak belirlendi; miktar değeri 15-87 ng/μL arasında değişmektedir (Tablo 1).

Sıralama ve biyoinformatik
Illumina yüksek verimli sıralayıcı, Nephele'ye aktarılan ve QIIME 2 platform^26'da görüntülenen bir FASTQ dosyası oluşturdu. İlk olarak, dizi kalitesini kontrol etmek için FastQC yazılımı kullan...

Tartışmalar

Metagenomik protokolü, üzüm şırasının örneklenmesinden başlar ve şıraya maya eklendiğinde, fermente şarap ve son şarap örnekleri. Bunu, bu örneklerden başarıyla ekstrakte edilen çift DNA ekstraksiyonu izledi. Elde edilen miktarların konsantrasyonu 15 ng/μL ila 87 ng/μL arasında değişmiştir. Bu, DNA ekstraksiyon protokolünün şarabın metagenomik çalışmaları için etkili olduğunu göstermektedir. A260/A280'deki DNA'nın kalitesi değişse de, bu, fermantasyon sırasında ve sonrasında gel...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation