Metagenomik Amplikon Dizileme Kullanılarak Şarap Üretimi Sırasında Fermente Traminette Üzümlerinin Bakteri Topluluğunun Profillenmesi

Özet

Burada, Traminette üzümlerinin, fermente üzümlerin ve nihai şarabın bakteri topluluğunu belirlemek için amplikon metagenomiğini tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Dizileme teknolojisindeki ilerlemeler ve mikrobiyal topluluk yapılarının profilini çıkarmak için biyoinformatik araçların kullanımına nispeten kolay erişim, üzüm ve şarapta hem kültürlenebilir hem de kültürlenemeyen mikropların daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmıştır. Endüstriyel fermantasyon sırasında, bilinen ve bilinmeyen mikroplar genellikle ürün geliştirme ve tatsızlıktan sorumludur. Bu nedenle, üzümden şaraba kadar bakterilerin profillenmesi, in situ mikrobiyal dinamiklerin kolay anlaşılmasını sağlayabilir. Bu çalışmada, Traminette üzümlerinin bakterileri fermantasyona tabi tutulmalı ve nihai şarap, 15 ng/μL ila 87 ng/μL veren DNA ekstraksiyonuna tabi tutulmuştur. V4 bölgesinin hiperdeğişken bölgesinin 16S amplikonu, filum Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota'dan oluşan nispeten bol bakteri ve ardından Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota ve Acidobacteriota'dan oluşan nispeten bol bakteriler dizilendi. Paylaşılan benzersiz operasyonel taksonomik birimlerin (OTU) bir Venn şeması analizi, 15 bakteri filumunun hem üzüm şırası, hem fermantasyon aşaması hem de son şarap için ortak olduğunu ortaya koydu. Daha önce bildirilmeyen filumlar, 16S amplikon diziliminin yanı sıra Enterobacteriaceae ve Lactobacillaceae gibi cinsler kullanılarak tespit edildi. Şarapta organik besin kullanımındaki varyasyon ve bunun bakteriler üzerindeki etkisi test edildi; Fermaid O içeren Traminette R tankı ve Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O ile uyarılan Traminette L . Kruskal-Wallis testi kullanılarak alfa çeşitliliği düzgünlük derecesini belirledi. Beta çeşitliliği, iki işlem için fermantasyon aşamasında bakterilerde bir kayma olduğunu gösterdi ve son şarap bakterileri benzer görünüyordu. Çalışma, şarap üretimi sırasında üzüm bakterilerinin kalitesini ve daha iyi kullanımını desteklemek için şarap üretimi sırasında bakteri değişikliklerini izlemek için 16S amplikon diziliminin kullanılabileceğini doğruladı.

Giriş

Traminette üzümü, kayda değer verim ve çeşitli mantar enfeksiyonlarına karşı kısmi dirence ek olarak üstün şarap kalitesi üretimi ile karakterize edilir ^1,2,3. Üzümlerin doğal fermantasyonu, ilişkili mikroorganizmalara, şarap üretim ortamına ve fermantasyon kaplarına^{dayanır 4,5}. Çoğu zaman, birçok şarap imalathanesi fermantasyon, alkol üretimi, esterler, aroma ve lezzet gelişimi için yabani maya ve bakterilere güvenir⁶.

Bu çalışmanın amacı, üzümlerin bakteri bileşimi....

Protokol

1. Deneysel şarap üretimi

1. Jonesville, Kuzey Carolina bağındaki Dynamis Estate şarabından Traminnette üzümleri elde edin, kökünü çıkarın ve şırayı iki ayrı 600 L'lik üstü açık fermentöre bırakmak için ezin ve kapakları kapalı olarak yaklaşık 4 gün kabukları üzerinde bırakın.
2. Derileri ıslak tutmak ve uçucu asit (VA) üretimini sınırlamak için kapakları günde bir kez yumruklayın.
   NOT: Buradaki fikir, aromatik öncülerin (monoterpenlerin) çoğunun kabuklarda yer alması ve şarabın aromatik potansiyelini artırmak için meyve suyunu deri ile temas halinde bırakmasıdır.
3. 4 gün sonra, Saccharomyces cerevisiae var cerevi....

Tartışmalar

Metagenomik protokolü, üzüm şırasının örneklenmesinden başlar ve şıraya maya eklendiğinde, fermente şarap ve son şarap örnekleri. Bunu, bu örneklerden başarıyla ekstrakte edilen çift DNA ekstraksiyonu izledi. Elde edilen miktarların konsantrasyonu 15 ng/μL ila 87 ng/μL arasında değişmiştir. Bu, DNA ekstraksiyon protokolünün şarabın metagenomik çalışmaları için etkili olduğunu göstermektedir. A260/A280'deki DNA'nın kalitesi değişse de, bu, fermantasyon sırasında ve sonrasında gel.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation