Kemirgen kemiklerinin tüm kemik bükme testlerini içeren çalışmaların tasarımı, yürütülmesi ve yorumlanması için pratik hususlar

Özet

Kemirgen kemiklerinin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili bilgileri çıkarmak için değerli bir yöntemdir. Uygun pratik anlayıştan yoksun olarak, sonuçlar aşırı yorumlanabilir veya geçerlilikten yoksun olabilir. Bu protokol, geçerli ve işlevsel veriler sağlamak için mekanik testlerin doğru bir şekilde yapılmasını sağlamak için bir kılavuz görevi görecektir.

Özet

Kırılmaya yol açan iskelet kırılganlığı, her yıl 1,5 milyon kırık ve 18 milyar dolarlık doğrudan bakım maliyeti ile sonuçlanan bir Amerikan halk sağlığı krizidir. Kemik hastalığının altında yatan mekanizmaları ve tedaviye yanıtı anlama yeteneği sadece arzu edilen değil, aynı zamanda kritiktir. Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığını anlamak ve ölçmek için değerli bir teknik olarak hizmet eder. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi basit görünse de, geçerli varsayımlar ve temel adımlar kullanıcı tarafından göz ardı edilirse uygunsuz ve yanlış sonuçlara varılabilir. Bu, yöntemlerin yanlış kullanımı ve sonuçların yanlış yorumlanması ile çalışmalar yayınlanmaya devam ettikçe disiplinler arasında gözlemlenmiştir. Bu protokol, mekanik testlerle ilgili ilkeler ve bu tekniklerin uygulanmasıyla birlikte - numune boyutunun dikkate alınmasından doku toplama ve depolamaya, veri analizi ve yorumlanmasına kadar - için bir astar görevi görecektir. Bununla birlikte, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili değerli bilgiler elde edilebilir ve hem akademik araştırmalar hem de klinik çözümler için daha iyi anlaşılabilir.

Giriş

Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili fonksiyonel bilgileri çıkarmak için birincil yöntemdir. Klinik öncesi çalışmalarda, çeşitli test yöntemleri kullanılabilir, ancak en yaygın olanı uzun kemiklerin bükülmesidir. Bu testlerin gerçekleştirilmesi kolaydır ve insandan fareye kadar değişen boyutlarda kemikler üzerinde kullanılabilir. Fareler, klinik öncesi araştırmalarda en sık çalışılan hayvanlardan biri olduğundan, bu protokol, farelerin femora ve tibiaları üzerinde yapılan bükme testlerine odaklanacaktır.

Bükme testleri yapılmadan önce kemikler uygun şekilde alınmalı ve saklanmalıdır. En yaygın saklama yöntemleri geleneksel olarak kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması, tek başına tuzlu suda dondurulması veya kemiklerin etanol ¹ içinde kurutulması olmuştur. Etanolde depolanan kemiklerin, donmuş olarak depolananlara kıyasla sertlik ve elastik modülün arttığı ve deformasyon parametrelerinin azaldığı gösterilmiştir¹. Testten önce kemikleri yeniden sulandırmak bile bu özellikleri normal seviyelere geri getirmez ¹. Tuzlu suya batırılmış olarak depolamak, salin genişledikçe basınç uygulandığından kemiğe zarar verebilir. Ek olarak, mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) taraması için kemikleri çıkarmak için çözeltinin tamamen çözülmesi gerekecektir. Sonuç olarak, taze hasat edilmiş kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması standart saklama yöntemi haline gelmiştir ve bu protokol boyunca tavsiye edilir.

Bir kemiğin büyüklüğü ve şekli kütle kuvvetini etkilediğinden ve birçok hastalık modeli kemik boyutunu ve morfolojisini önemli ölçüde değiştirdiğinden, dokunun davranışını tahmin eden özellikler üretmek için boyutun etkilerini normalleştirmek için mühendislik ilkeleri kullanılır². Bu yaklaşım, testten önce kemiklerin taramalarını oluşturmak için en yaygın olarak μCT kullanılarak elde edilen başarısızlık yerinin enine kesit geometrisini gerektirir. μCT, kullanılabilirliği ve yüksek görüntü çözünürlüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, yumuşak dokunun katkıları dahil değildir ve tarama, kemiğe kimyasal fiksasyon veya başka değişiklikler gerektirmez ^3,4. Tüm CT formlarında, bir X-ışını kaynağı bir nesneye odaklanırken, nesnenin diğer tarafındaki bir dedektör ortaya çıkan X-ışını enerjisini ölçer. Bu, numunenin bir görüntüye^{dönüştürülebilen} bir X-ışını gölgesi üretir ^3,5. Taranan nesne döndürülür (veya X-ışını kaynağı ve dedektör numunenin etrafında döndürülür), nesneyi temsil eden üç boyutlu bir veri setine yeniden oluşturulabilen görüntüler üretilir⁵.

Tarama çözünürlüğü veya iki nesnenin birbirine ne kadar yakın olabileceği ve yine de ayrı ayrı çözümlenebileceği, elde edilen görüntüdeki nominal voksel boyutu veya bir pikselin boyutu değiştirilerek kontrol edilir. Genel olarak, nesnelerin tanımlanması için tek bir vokselin en az iki katı büyüklüğünde olması gerektiği^{kabul edilir 3}, ancak daha yüksek bir oran daha fazla hassasiyet sağlayacaktır. Ayrıca, daha büyük vokseller kısmi hacim etkilerine daha yatkındır: tek bir voksel farklı yoğunluklarda dokular içerdiğinde, tek bir dokunun özgül yoğunluğundan ziyade bu yoğunlukların ortalamasına atanır, bu da doku alanlarının ve mineral yoğunluğunun fazla veya eksik tahmin edilmesine yol açabilir³. Bu sorunlar daha küçük voksel boyutları seçilerek hafifletilebilse de, daha yüksek bir çözünürlük kullanmak kısmi hacim etkilerinin ortadan kaldırılmasını sağlamaz ve daha uzun tarama süreleri gerektirebilir³. Kemikleri ex vivo olarak tararken, fare kemiklerinin trabeküler mimarisini doğru bir şekilde değerlendirmek için genellikle 6-10 μm'lik bir voksel boyutu önerilir. Kortikal kemik için 10-17 μm'lik daha büyük bir voksel boyutu kullanılabilir, ancak en küçük makul voksel boyutu kullanılmalıdır. Bu protokol, temel trabeküler özellikleri ayırt etmek ve kapsamlı tarama süresi olmadan kısmi hacim etkilerini en aza indirmek için yeterince küçük olan 10 μm'lik bir voksel boyutu kullanır.

Kemik dokusunun yüksek mineral yoğunluğu ve kalınlığı, iletilen X-ışını enerji spektrumunu büyük ölçüde zayıflattığı ve değiştirdiği için X-ışını enerjisi ve enerji filtresi ayarları da dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Genel olarak, yayılan X-ışını spektrumunun nesne^6'dan çıkan spektruma eşdeğer olduğu için, kemik gibi yoğun nesneler üzerinde düşük enerjili X-ışınlarının kullanılmasının, ışın sertleşmesi⁷ olarak bilinen bir artefakta yol açabileceği varsayılır. Bu artefaktların insidansını azaltmak için kemik örneklerini tararken 50-70 kVp'lik daha yüksek bir voltaj önerilir⁵. Ek olarak, bir alüminyum veya bakır enerji filtresinin takılması, daha konsantre bir enerji ışını oluşturarak artefaktları daha da en aza indirir ^4,7. Bu protokol boyunca 0,5 mm alüminyum filtre kullanılacaktır.

Son olarak, tarama döndürme adımı ve döndürme uzunluğu (örneğin, 180°-360°), son taramadaki gürültü miktarını belirleyen^yakalanan görüntü sayısını birlikte kontrol eder 4. Her adımda birden fazla karenin ortalamasını almak gürültüyü azaltabilir ancak tarama süresini artırabilir⁴. Bu protokol, 0,7 derecelik bir döndürme adımı ve 2 derecelik bir çerçeve ortalaması kullanır.

Tarama hakkında son bir not: hidroksiapatit kalibrasyon fantomları, zayıflama katsayılarının g/^cm35 cinsinden mineral yoğunluğuna dönüştürülmesini sağlamak için deneysel kemiklerle aynı tarama ayarları kullanılarak taranmalıdır. Bu protokol, farklı fantomlar mevcut olmasına rağmen, 0.25 g/^cm3 ve 0.75 g/^cm3 hidroksiapatit fantomları kullanır. Bazı tarama sistemlerinin, günlük sistem kalibrasyonunun bir parçası olarak dahili fantomlar kullandığını unutmayın.

Tarama tamamlandıktan sonra, açısal çıkıntılar, tipik olarak üreticinin eşlik eden yazılımı kullanılarak nesnenin kesit görüntülerine dönüştürülür. Hangi sistem kullanılırsa kullanılsın, rekonstrüksiyonda tüm kemiğin yakalandığından ve eşiğin kemik ile kemik olmayanın tanınmasına izin verecek şekilde uygun şekilde ayarlandığından emin olmak önemlidir. Rekonstrüksiyondan sonra, tüm taramaları üç boyutlu olarak döndürmek çok önemlidir, böylece kemikler yine üreticinin yazılımını kullanarak enine eksenle tutarlı ve düzgün bir şekilde hizalanır.

Rotasyonu takiben, mekanik normalizasyon için kortikal özellikler, trabeküler özellikler veya kırılma geometrisinin istenip istenmediğine bağlı olarak analiz için ilgi alanları (ROI) seçilebilir. İkincisi için, kırık bölgesinden kemiğin bir ucuna olan mesafeyi ölçerek ve tarama dosyasında karşılık gelen dilim konumunu belirlemek için voksel boyutu kullanılarak test edildikten sonra ROI'ler seçilmelidir. Seçilen bölge en az 100 μm uzunluğunda olmalı ve kırılma noktası ROI'nin yaklaşık merkezinde olmalıdır⁴.

ROI'ler seçildiğinde, mekanik normalizasyon için iki özellik gereklidir (eğilme gerilimini ve gerinimini hesaplamak için): nötr eğilme ekseninden arızanın başlatıldığı yüzeye olan maksimum mesafe (test kurulumu tarafından belirlenen, gerilimde yüklü yüzey olduğu varsayılır) ve nötr eksen etrafındaki atalet momenti alanı (ayrıca test kurulumuna bağlıdır). Bu protokol, bu değerleri belirlemek için özel bir kod kullanılmasını önerir. Koda erişmek için doğrudan ilgili yazarla iletişime geçin veya daha fazla bilgi için https://bbml.et.iupui.edu/ adresindeki laboratuvar web sitesini ziyaret edin.

μCT taraması tamamlandıktan sonra mekanik test başlayabilir. Bükme testleri, dört noktalı veya üç noktalı konfigürasyonlarda gerçekleştirilebilir. Dört noktalı eğilme testleri, yükleme noktaları arasındaki kemikteki kayma gerilmesini ortadan kaldırdığı ve bu bölgede saf eğilmenin gerçekleşmesine olanak sağladığı için tercih edilmektedir³. Kemik daha sonra gerginlik nedeniyle kırılacak ve kemiğin gerçek bükülme özelliklerini daha iyi temsil eden bir başarısızlık yaratacaktır³. Bununla birlikte, kemik, her iki yükleme noktasında da aynı yükü verecek şekilde yüklenmelidir (bu, döner bir yükleme kafası ile kolaylaştırılabilir). Üç nokta eğilme testlerinde, yük noktasının kemikle birleştiği yerde kayma gerilmesinde büyük bir değişiklik olur ve bu da kemiğin bu noktada gerilme³ değil kayma nedeniyle kırılmasına neden olur. ASTM standartları, bükülmeye maruz kalan malzemelerin uzunluk-genişlik oranının 16:1 olmasını önermektedir,^{yani kesme 8,9} etkilerini en aza indirmek için destek açıklığının uzunluğu kemiğin genişliğinden 16 kat daha büyük olmalıdır. Küçük kemirgen kemiklerini test ederken bunu başarmak genellikle imkansızdır, bu nedenle yükleme aralığı mümkün olduğunca büyük, ancak enine kesit şeklinde mümkün olduğunca küçük bir değişiklikle yapılır. Ayrıca, dört noktalı bükme yapılırken, alt ve üst açıklığın uzunlukları arasındaki oran ~3:1⁸ olmalıdır, bu genellikle tibiada elde edilebilir, ancak daha kısa femurda zordur. Ek olarak, femurların daha ince kortikal duvarları, onları test sırasında kemik kesitinin şeklini değiştiren halka tipi deformasyona duyarlı hale getirir (bu, üç noktalı bükülmeye kıyasla aynı bükülme momentini indüklemek için daha büyük bir kuvvet gerektiğinden dört noktalı testlerde vurgulanabilir). Bu nedenle, bu protokol boyunca fare femora için üç noktalı bükme kullanılırken, tibia için dört noktalı bükme kullanılacaktır.

Son olarak, istatistiksel analiz için çalışmayı uygun şekilde güçlendirmek önemlidir. Mekanik testler için genel bir öneri, bazı mekanik özellikler, özellikle akma sonrası parametreler oldukça değişken olabileceğinden, farklılıkları tespit edebilmek için deney grubu başına 10-12 kemiklik bir örneklem büyüklüğüne sahip olmaktır. Bazı durumlarda, bu, çalışma sırasında meydana gelebilecek yıpranma göz önüne alındığında daha yüksek bir hayvan örneklem büyüklüğü ile başlamak anlamına gelebilir. Bir çalışmaya başlamadan önce mevcut veriler kullanılarak örneklem büyüklüğü analizi tamamlanmalıdır.

Çok sayıda sınırlama ve varsayım vardır, ancak bükme testleri, özellikle gruplar arasındaki göreceli farklılıklar söz konusu olduğunda oldukça doğru sonuçlar verebilir. Bu özellikler, trabeküler mimari ve kortikal morfolojinin analizi ile birlikte, hastalık durumları ve tedavi rejimleri hakkında daha iyi bilgi sağlayabilir. Deneyin kontrolümüzde olan yönlerine (örneğin, hasat, depolama, tarama ve test etme) dikkat edilirse, doğru sonuçların üretildiğinden emin olabiliriz.

Protokol

Bu protokol boyunca açıklanan ve hayvanları içeren tüm prosedürler, prosedürden önce Indiana Üniversitesi Fen Bilimleri Okulu Kurumsal Hayvan ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Prosedürde tarif edilen hayvanlar, CO₂inhalasyonu yoluyla ötenazi yapıldı ve ardından ikincil bir ötenazi aracı olarak servikal çıkık yapıldı.

1. Kemiklerin toplanması, depolanması ve çözülmesi

1. Hasat ve depolama
   1. Fareyi ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Bir tarafta femur ve pelvisin yaklaşık birleşim yerinde bir kesi yapmak için bir neşter (veya tıraş bıçağı veya makas) kullanın.
   2. Kalça eklemi bulunana kadar ilk insizyona dorsal olarak devam edin; Pelvise bağlı küçük beyaz bir küre gibi görünen femur başını arayın.
   3. Femur başı yuvadan çıkana kadar femur başının proksimal kenarına bir neşter kenarı ile basınç uygulayın. Arka ayağı karkasın geri kalanından kurtarmak için ek dokuyu çıkarın.
   4. Arka bacak izole edilmişken, diz ekleminde fleksiyonu indükleyerek tibia ve femuru ayırın. Kemikler arasındaki bağlar da dahil olmak üzere herhangi bir bitişik dokuyu kesmek için neşteri dizin ön yüzeyinde medial-lateral yönde hareket ettirin.
   5. Bu kemikleri ayırmazsa, arka yüzeye erişime izin vermek için diz eklemini uzatın. Kemiği kesmekten veya eklem kıkırdağını kazımaktan kaçınmaya dikkat edin.
   6. Femur ve tibia ayrıldıktan sonra, eklemi esneterek ve eklemin arka yüzeyinde medial-lateral bir testere hareketi kullanarak arka ayağı tibiadan çıkarın. Gerekirse, ön yüzeyi ortaya çıkarmak için eklemi uzatın. Kemiği kesmemeye dikkat edin.
   7. İzole edildikten sonra, tüm yapışkan yumuşak dokuların kemiklerini temizleyin. Tibia üzerinde dört noktalı bükme testleri yapıyorsanız, fibulayı da çıkarın. Fibula, proksimal uçtaki bağlarla bağlanır, ancak kemiğin distal ucuna yakın tibiaya kaynaşır. Fibulayı ayırmak için bağlantı noktasının yakınında keskin bir makas kullanın.
   8. İzole edilmiş ve temizlenmiş kemikleri ayrı ayrı tuzlu suya batırılmış gazlı beze sarın ve -20 °C'de saklayın. Bunu hasattan hemen sonra yapın.
   9. Karkasın diğer tarafı için 1.1.1'den 1.1.8'e kadar olan adımları tekrarlayın.
      NOT: 1.1.4-1.1.6 adımlarında kemikleri ayırmaya çalışırken direnç varsa, kemikleri ayırmaya çalışmak yerine adımları tekrarlamak en iyisidir. Kuvvetli hareketler kemiklerin hasar görmesine veya kırılmasına neden olabilir.
2. Çözdürme
   NOT: Aşırı donma-çözülme döngüleri kemiğin mekanik özelliklerini zararlı bir şekilde etkileyebileceğinden, bir kemiğin maruz kaldığı donma-çözülme döngülerinin sayısı en aza indirilmelidir. μCT taraması için kısmi çözülme, kemiğin oda sıcaklığında 5-10 dakika bekletilmesiyle sağlanabilir. Kemiği sadece aşağıda açıklandığı gibi bükme testleri yaparken tamamen çözün.
   1. Bir gecede çözülme tercih edilir
      1. Kemikleri -20 ° C'deki depolamadan soğuk bir odada veya buzdolabında 1-4 ° C'ye taşıyın. Testten önce kemiklerin tamamen çözülmesi için 8-12 saat orada kaldığından emin olun.
   2. Hızlı çözülme
      1. Banyo sıcaklığını yaklaşık 37 °C'ye ayarlayın. Bu sıcaklığa geldikten sonra kemikleri banyoya ekleyin.
      2. Kemikleri banyoda yaklaşık 1 saat bekletin.

2. μCT taraması

1. Hidrasyonu korumak için taramadan önce kemikleri parafilme sarın. Taranmayı beklerken diğer tüm kemikleri buz üzerinde tutun.
2. Parafilme sarıldıktan sonra, tarayıcıyla arayüz oluşturmak için kemiği bir tutucuya yerleştirin. Taranan tüm kemiklerin aynı yönde hizalandığından emin olun, çünkü tutarlı hizalama analizin ilerleyen bölümlerinde döndürmeyi basitleştirecektir.
3. Tarama ayarlarını, taramanın uygulanmasına göre ayarlayın. Fare kemikleri için aşağıdaki genel tarama ayarları önerilir: çözünürlük/voksel boyutu: 10 μm; piksel boyutu: orta, 2000 x 1048; filtre: 0,5 mm alüminyum; Dönme adımı: 0.7; Çerçeve ortalaması: 2.
   NOT: Bu ayarlar, tarama için kullanılan sisteme bağlı olarak farklılık gösterebilir ve gerektiğinde üreticinin ve kullanım kılavuzunun kullanımına başvurulmalıdır.
4. X-ışını kaynağı açıldıktan sonra, artefaktları en aza indirmek için düz alan düzeltmesi yapın. Bunu yapmak için önce haznenin boş olduğundan emin olun ve düz alanı kapatın.
5. Alanın ortalama yoğunluğunu ölçün ve %60'a ayarlayın. %60'a ulaştığında, düz alanı güncelleyin ve tekrar açın.
6. Ortalama yoğunluğun şimdi (%86-88) olduğundan emin olun.
   NOT: Bu işlem kullanılan μCT sistemine göre değişiklik gösterebilir. İşlemi denemeden önce kullanım kılavuzuna bakın.
7. Düz alan düzeltmesi başarıyla gerçekleştirildikten sonra, tutucuyu hazneye yerleştirin. Kaideyi hazneye yerleştirmeden önce numunelerin ortalandığından ve düz olduğundan emin olun.
8. Kaide sabitlendikten sonra, odayı kapatın, tüm kemiğin taramada yakalanacağından emin olun (bir izci görünümü gerekli olabilir) ve taramayı başlatın.
9. Taramanın ardından, kemikleri tuzlu suya batırılmış gazlı bezde -20 °C'de tekrar saklayın.

3. μCT rekonstrüksiyonu

1. Rekonstrüksiyon sırasında tüm kemiği yakalayacak bir ROI seçin. Bunu yapmak için, kemiğin en büyük kesitini görüntüleyin ve bu kesite göre ROI'yi boyutlandırın.
2. Kemik olmayana kıyasla kemiğin düzgün tanınmasını sağlamak için yazılımın eşiğini ayarlayın. Bunu yapmak için, en yüksek histogram verilerinin sonunda alt kısıtlamanın 0 olarak ayarlandığı ve üst kısıtlamanın ayarlandığı bir histogram kullanın.
3. Halka artefaktı azaltma ve ışın sertleştirme dahil olmak üzere ek ayarları sırasıyla %5 ve %20'ye ayarlayın. Yanlış hizalama telafisinin -7 ila 7 aralığında olup olmadığını kontrol edin. Bu değerler yazılıma göre değişiklik gösterebilir. Yeniden yapılanmaya başlamadan önce kullanım kılavuzu ve üretici bazlı talimatlarla doğrulandıklarından emin olun.
   NOT: Işın sertleştirme, halka artefaktları ve yanlış hizalama telafisi için düzeltmeler kullanılarak yeniden yapılandırma sırasında artefaktlar en aza indirilebilir. Yanlış hizalama telafisi, taramanın kalitesinin bir göstergesi olarak işlev görebilir ve üretici tarafından belirtilen aralığın dışındaysa taramanın tekrarlanması gerekir. Ancak, yeniden yapılandırma ayarları yazılıma bağlı olacaktır ve kullanım kılavuzuna başvurulmalıdır.

4. μCT rotasyonu

NOT: Yeniden yapılandırıldıktan sonra, tüm kemikler arasında tutarlı bir oryantasyon oluşturmak ve ortaya çıkan kemiğin enine kesitlerinin mümkün olduğunca az ofset açısıyla uzunlamasına eksene normal olarak alınmasını sağlamak için taramalar döndürülmelidir. Bu, kullanıcının tercih ettiği yazılımla yapılmalıdır.

1. Femur rotasyonu
   1. Femuru, tüm kemikler aynı uzunlamasına oryantasyona sahip olacak şekilde döndürün. Örneğin, tüm kemikleri, kemiğin proksimal ucu taramanın üst kısmında olacak şekilde yönlendirin.
   2. Kemiği, tüm kemiklerin kesit yönü aynı olacak şekilde döndürün. Örneğin, ön taraf her zaman taramaların sağ tarafında olacak şekilde kemikleri döndürün.
   3. Bu ayarlamalar yapıldıktan sonra, merkezi eksen etrafında simetrinin korunduğundan emin olmak için taramayı düzeltin.
   4. Döndürülen veri kümesini kaydedin.
2. Tibia rotasyonu
   1. Tibia için 4.1.1-4.1.4 adımlarını tekrarlayın.

5. Mekanik test prosedürü

1. Hazırlık
   1. Mekanik testten önce, 6-10 μm çözünürlüklü bir μCT taramasının elde edildiğinden ve kırılma bölgesindeki kesit geometrisini hesaplamak için her numune için kaliteli bir taramanın yapıldığını doğrulamak için yeniden yapılandırıldığından emin olun (bölüm 2-3).
   2. Elde edilen ve doğrulanan taramalarla, testten önce tüm kemikleri çözün (bölüm 1). Aynı gün bir deneydeki tüm kemikleri test edin ve örnekler ve deney grupları arasında kullanıcı yanlılığını ve sistem değişkenliğini en aza indirmek için test sırasını rastgele seçin. Test süreci boyunca kemiklerin nemli kaldığından emin olun.
2. Aparat kurulumu
   1. Numune için uygun hassasiyet ve kapasiteye sahip bir yük hücresi bulun. Numune için beklenen arıza aralığını göz önünde bulundurun ve hassasiyeti en üst düzeye çıkarırken yaklaşık %50 daha fazla kapasiteye sahip bir yük hücresi seçin (örneğin, 0-25 N arıza aralığındaki bir fare kemiği için 45 N kapasiteli 10 lbf'lik bir yük hücresi).
   2. Yükleme ve destek açıklığı armatürlerini bulun.
   3. Yük hücresini ve fikstürleri Şekil 1'de gösterildiği gibi, yük hücresini test cihazının üst veya alt desteğine, üstten yükleme fikstürünü yük hücresine ve alt fikstürü test cihazının alt desteğine vidalayarak takın. Güvenli bir şekilde oturduğundan emin olun.
      NOT: Sıvının yük hücresi ile temasını önlemek için bükme testleri yapılırken genellikle yük hücresinin üst fikstüre takılması önerilir, ancak gerekirse alt kısım kullanılabilir.
   4. Yük hücresi ve fikstürler kurulduktan sonra, bir destek açıklığı uzunluğu seçin ve test edilen tüm numuneler için sabit kaldığından emin olun. Bir destek açıklığı mesafesi seçmek için önce numune setindeki en kısa kemiği bulun.
   5. Kemiği Şekil 2'de gösterildiği gibi fikstürler arasında yönlendirin.
   6. Femurun üç noktadan bükülmesi için Şekil 2A'yı takip edin. Kemiğin ön yüzeyinin destek açıklığına karşı olduğundan ve açıklık bölgesinin numunenin diyafizi içinde olduğundan emin olun. Proksimal uçtaki üçüncü trokanteri ve kemiğin metafize doğru genişlediği geçiş noktasını ve distal uçta kondilleri dahil etmekten kaçının.
   7. Dört noktalı bükme için, destek ve yükleme açıklıklarının birbiriyle hizalandığından ve ortalandığından emin olun. Kemiği fikstürlere yüklemek için Şekil 2B'yi izleyin.
      1. Destek ve yükleme açıklıkları uzunluklarını 3:1 oranını⁸ takip edecek şekilde ayarlayın (örneğin, 9 mm destek açıklığı ve 3 mm yükleme açıklığı).
      2. Bir tibia için, kemiğin medial yüzeyini tibia / fibula kavşağında bir destekle destek açıklığına karşı yükleyin. Diğer destek muhtemelen tibial krestten hemen sonra konumlandırılacaktır. Destek açıklığı içinde ortalanmış yükleme açıklığının kemiğin tek tip bir bölgesini içerdiğinden emin olun.
   8. Üç noktalı bükme yapıyorsanız destek açıklığı mesafesini ve 4 noktalı bükme yapıyorsanız hem yükleme hem de destek açıklığı mesafelerini ölçün ve bu mesafeleri kaydedin. Hem yükleme hem de destek açıklığı ölçümleri için bu değerin yükleme noktalarının ortasından kaydedildiğinden emin olun.
   9. Kemiği tekrar salin içine yerleştirin veya bir bolus salin ile rehidre edin.
      NOT: Bir yükleme açıklığı için noktalar seçerken, dairesel noktaların kullanılması önerilir (0.75 mm'lik bir yarıçap, yükü dağıtırken aynı zamanda dairenin tanjantında kemiğe temas ettiği için yeterlidir). Teori, bir nokta yükünü temsil etmek için bir bıçak sırtı önerirken, bu, yük uygulama noktasında kemiği ezecek ve gerilmenin fazla tahmin edilmesine ve modülün hafife alınmasına yol açacaktır.
   10. Armatürün tüm parçalarının sıkı ve hareketsiz olduğundan emin olun.
3. Yazılım kurulumu
   1. Test cihazının modül kutusu, yük hücresi kanalları ve sistem kılavuzuna göre diğer gereksinimler aracılığıyla bilgisayara düzgün şekilde bağlandığından emin olun.
   2. Mekanik test cihazıyla ilişkili yazılımda, kemiği arızaya yüklemek için viskoelastik etkilere neden olmayacak kadar yavaş bir yer değiştirme hızına sahip bir rampa ile bir bükme testi profili oluşturun (genellikle 0,025 mm/sn kullanılır).
   3. Daha yüksek bir örnekleme hızı tercih edilmesine rağmen, bir test profili oluştururken minimum 25 Hz örnekleme frekansı da önerilir.
   4. Her çalışma grubu için bir klasör oluşturun ve her testi bu klasör içinde ayrı bir dosya olarak kaydedin.
4. Numunelerin yüklenmesi ve test edilmesi
   1. Düzgün çözülmüş bir kemik seçin (bkz. adım 1.2). Kaliperlerle tam uzunluğunu ölçün ve kaydedin.
   2. Numuneyi Şekil 2A'da gösterildiği gibi fikstürlere yükleyin üç noktalı bükmede bir uyluk kemiği test ediliyorsa ve dört noktalı bükülmede bir tibia test ediliyorsa Şekil 2B.
   3. Dosya adını, test edilen örneği yansıtacak şekilde değiştirin.
   4. Yükü sıfırlayın (yer değiştirmeyi değil). Sistemin taşıyıcısını açın; Yük veya yer değiştirme kontrolünde olmadığından emin olun.
   5. Dikkatli kullanarak, konumunu sabitlemek ve kemiğin yuvarlanmasını önlemeye yardımcı olmak için kemiğe minimum ön yük uygulayın, ancak numuneyi tehlikeye atmadığından emin olun. Yaklaşık 0,25 N'luk bir ön yük hedefleyin. Devam etmeden önce istenen kemik oryantasyonunun korunduğundan emin olun.
   6. Numuneyi cömertçe tuzlu su ile ıslatarak nemlendirin.
   7. Yazılımda Başlat veya Çalıştır'ı seçerek bükme testine başlayın. KRİTİK : Testin tamamı için numuneyi dikkatlice izleyin ve herhangi bir sorunun oluştuğu testleri not edin (örneğin, yuvarlanma, kayma).
      NOT: Bu sorunlar verileri tehlikeye atabilir ve bu testlerle ilgili notlara analiz sırasında başvurulması yararlı olacaktır.
   8. Kemiğin kırılmaya başlamasına dikkat edin (gerilme tarafında). Çoğu test, hata oluşana kadar devam eder. Bu noktada test, programlanan limitleri üzerinden sona erecektir. Arıza meydana gelirse ancak test cihazı yer değiştirmeye devam ederse, yük hücresinin hasar görmesini önlemek için testi manuel olarak durdurun.
   9. Test tamamlandıktan sonra, kaliperler kullanarak distal uçtan kırılma noktasına kadar olan uzunluğu ölçün ve kaydedin.
   10. Her örnek için 5.4.1 – 5.4.9 adımlarını tekrarlayın.

Şekil 1: Mekanik test cihazı kurulumu. (A) Üç nokta ve (B) dört nokta bükme testleri. Yük hücresi sarı renkle, yükleme fikstürleri mavi renkle ve destek fikstürleri yeşil renkle gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fikstürler arasındaki kemiklerin oryantasyonu. (A) Doğru konumlandırıldığında femurun medial, anterior ve posterior tarafından (yukarıdan aşağıya) görünümleri gösteren üç noktalı eğilme yükleme fikstürlerinde bir femurun uygun oryantasyonu. Yükleme fikstürleri turuncu renkle gösterilir ve destek fikstürleri mavi renkle gösterilir. Alt açıklıklar, diyafizin mümkün olduğunca düz kısmını içerecek şekilde ayarlanmalı ve üst fikstür bu açıklıklar arasında ortalanmalıdır. (B) Tibianın ön, lateral ve medial taraflarından (yukarıdan aşağıya) görünümleri gösteren dört noktalı bükülme için bir tibianın uygun oryantasyonu. Kemik, medial yüzey alt fikstüre temas edecek ve yan yüzey üst fikstüre temas edecek şekilde yüklenmelidir. Tibia-fibula bileşkesi, yükleme aralığının hemen dışına yerleştirilmelidir. Açıklıklar, 1:3'lük bir yükleme-destek açıklığı oranını en iyi şekilde karşılayacak şekilde ayarlanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Yatırım getirisi seçimi

1. Kırılma uzunlukları kaydedildikten sonra, döndürülen görüntüleri kullanıcının tercih ettiği yazılıma yükleyin. Döndürülen görüntüler yüklendikten sonra, kemiğin üst ve alt dilimlerini bulun ve kaydedin.
2. Üst ve alt dilimler arasındaki farkı hesaplayın. Kemiğin toplam uzunluğunu mikrometre cinsinden belirlemek için bu değeri tarama voksel boyutuyla çarpın.
3. BT taramasında kırık yerini bulmak için, taramanın distal ucundan kırılma noktasına kadar μCT dilimlerinin sayısını elde etmek için kaydedilen kırılma uzunluğunu (mikrometre cinsinden) voksel boyutuna bölün.
4. Bu konumda ortalanmış bir ROI seçin. İlk olarak, ROI'nin istenen toplam uzunluğunu ayarlayın (en az 100 μm). ROI'deki toplam dilim sayısını belirlemek için mikrometre cinsinden uzunluğu voksel boyutuna bölerek bu uzunluğun temsil ettiği dilim sayısını bulun.
5. ROI'nin alt sınırını elde etmek için, toplam ROI dilimi sayısını 2'ye bölün ve bu değeri adım 6.4'te bulunan önceden hesaplanan kesme konumundan çıkarın.
6. ROI'nin üst sınırını elde etmek için ROI'nin dilimler içindeki toplam uzunluğunu daha önce hesaplanan değere ekleyin.
7. Hesaplanan sınırlara göre uygun yatırım getirisini seçin ve kaydedin.

7. Kuvvet ve yer değiştirme verilerinin normalleştirilmesi

NOT: Mekanik test cihazı yalnızca x ve y koordinatlarına (yer değiştirme, kuvvet) sahip noktalar üretecektir. Bu noktalar, Euler-Bernoulli eğilme gerilimi ve gerinim denklemleri kullanılarak gerilme ve gerinim denklemlerine dönüştürülebilir, ancak bunlar μCT taramalarından elde edilen geometrik özellikler gerektirir. Bu özelliklerin nicelleştirilmesi, kullanıcının tercih ettiği yazılımla gerçekleştirilebilir. Tüm girdiler, hesaplamalar ve çıktılar üzerinde tam kontrol sağlayan özel bir kodu tercih ediyoruz. Daha önce de belirtildiği gibi, koda erişim için doğrudan ilgili yazarla iletişime geçin veya daha fazla bilgi için https://bbml.et.iupui.edu/ adresindeki laboratuvar web sitesini ziyaret edin. Bunları hesaplamak için gerilim ve gerinim denklemleri ile μCT taramalarından elde edilmesi gereken gerekli geometrik özellikler aşağıda tartışılmaktadır.

1. Üç noktalı eğilme normalizasyon denklemleri
   1. Üç noktalı eğilmede gerilimi hesaplamak için kullanılan denklem aşağıda Denklem 1'de gösterilmiştir. Bu denklemde "F" kuvveti, "L" ise destek açıklığının uzunluğunu temsil eder. Kuvvet değerleri, test sırasında mekanik test cihazı tarafından kaydedilir. Testten önce destek açıklığının uzunluğunun kaydedildiğinden emin olun. "c" ve "I", μCT taramaları kullanılarak hesaplanacak geometrik özelliklerdir (bölüm 7.3).
      (1)
   2. Gerinimi hesaplamak için denklem aşağıda Denklem 2'de gösterilmiştir; "c" ve "L", hem gerilim hem de gerinim hesaplamaları için aynı özellikleri temsil eder. "D", testler sırasında mekanik test cihazı tarafından kaydedilen yer değiştirme değerlerini ifade eder.
      (2)
2. Dört noktalı eğilme normalizasyon denklemleri
   1. Dört noktalı eğilmede gerilme denklemi aşağıda Denklem 3'te gösterilmiştir. "F" ve "I", adım 7.1.1'de tartışılan değişkenlerin aynısı olarak kalır. Testten önce destek ve yükleme açıklığı ölçümlerinden "a"yı hesaplayın. Dört noktalı bükme için destek / yükleme açıklığı için önerilen 3: 1 oranını takip ediyorsanız, "a" destek açıklığı uzunluğunun üçte biri olacaktır.
      (3)
   2. Dört noktalı eğilmede gerinim denklemi aşağıda Denklem 4'te gösterilmiştir. "c" ve "a", hem gerilme hem de gerinim hesaplamaları için aynı özellikleri ifade eder. "D", testler sırasında mekanik test cihazı tarafından kaydedilen yer değiştirme değerlerini ifade eder.
      (4)
3. μCT taramalarından geometrik özelliklerin hesaplanması
   1. "c" değişkeni, nötr eksenden gerilimle yüklenen kemiğin yüzeyine olan mesafeyi temsil eder. Sonuç olarak, nötr eksen merkezden geçtiği için μCT taramalarında her bir kesitin merkezini belirleyin.
      1. Adım 5.2.6'da açıklanan üç noktalı bükülmede bir uyluk kemiğinin test oryantasyonunu takip ediyorsanız, ön yüzeye göre "c" yi ölçün.
      2. Adım 5.2.7'de açıklanan bir tibianın test oryantasyonunu takip ediyorsanız, kemiğin medial yüzeyine göre "c" yi ölçün.
   2. "I" değişkeni, bükülme ekseni (femur için medial-lateral eksen; tibia için ön-arka eksen) etrafındaki atalet momentini temsil eder. Denklem 5'i kullanarak bu değeri hesaplayın. Bu denklemde "dA", μCT taramasında yakalanan her pikselin alanıdır, y ise her pikselin nötr eksenden hesaplanan uzaklığıdır.
      (5)

8. İlgilenilen mekanik test özellikleri

1. Herhangi bir mekanik özelliği hesaplamadan önce, bir kuvvet-yer değiştirme eğrisi ve gerilim-gerinim eğrisi oluşturun (önemli özelliklerle birlikte aşağıda Şekil 3'te gösterilen ideal eğriler).
   NOT: Biyolojik numunelerin test edilmesi her zaman bu idealize edilmiş örneklere benzeyen eğriler oluşturmaz, ancak bunlar yararlı bir kılavuz olmaya devam eder.
2. Kemik yuvarlanması veya kayması gibi test hatalarını tespit etmek için analizden önce bu eğrileri inceleyin. Bu hatalar tipik olarak eğrinin ilk doğrusal kısmında tümseklere veya düz bölgelere neden olur. Bu noktada, test cihazı kemiğe temas etmeden önce toplanmış olabilecek veriler veya arızadan sonraki veriler de dahil olmak üzere fazla verileri kaldırın.
3. Çizilen eğriler tarafından bir kalite testinden emin olduktan sonra, önemli özelliklerin analizine başlayın.
   1. Sertlik ve elastik modül
      1. Kuvvet-yer değiştirme eğrisinin yalnızca elastik bölgesini kullanarak sertliği hesaplayın. Bu bölgedeki eğrinin eğimi sertliktir.
      2. Gerilim-gerinim eğrisinin sadece elastik kısmının eğimini kullanarak elastik modülü hesaplayın.
   2. Verim noktası
      NOT: Biri kuvvet-yer değiştirme eğrisi ve diğeri gerilim-gerinim eğrisi üzerinde olmak üzere iki akma noktası vardır. Kuvvet-yer değiştirme eğrisinden bu nokta için (x,y) değerleri, akma kuvvetine yer değiştirme ve akma kuvveti olarak bilinirken, gerilim-gerinim eğrisinden gelenler, gerinim-akma ve akma gerilimi olarak bilinir. Bu noktalar, eğrinin elastik bölgesinin sonunu temsil eder ve aşağıda listelenen şekillerde bulunabilir.
      1. Gerilim-gerinim eğrisi yöntemi: (0,0)'dan %0,2 gerinim (2,000 mikrostrain) ile ancak elastik modülle aynı eğime sahip bir çizgi ofseti hesaplayın. Bu çizgiyi gerilim-gerinim grafiğinde çizin; Bu çizginin gerilim-gerinim eğrisini kestiği konum, akma noktası olarak tanımlanır. Benzer kuvvet ve yer değiştirme değerlerini bulmak için bu akma gerilimi ve gerinim koordinatını kullanın; Bu değerler, akma kuvvetini ve yer değiştirmeden verim değerlerine temsil edecektir.
      2. Sekant yöntemi: Kuvvet-yer değiştirme eğrisinden sertliği hesaplayın ve sertliği seçilen bir yüzde (%5-10) kadar azaltın. Bu azaltılmış sertliğin eğimi ile (0,0) 'dan başlayan bir çizgi çizin ve kuvvet-yer değiştirme eğrisi ile kesişmesine izin verin. Kesişme noktası koordinatlara sahip olacaktır (yer değiştirmeden verime, akma kuvveti).
         NOT: Sekant yöntemi, gerilim-gerinim verileri olmadan akma noktasını bulmak için kullanılabilir.
   3. Nihai güç ve nihai stres
      1. İlgili veri setlerinde maksimum değeri bularak nihai kuvveti ve nihai gerilimi hesaplayın.
   4. Yer değiştirme ve gerinim özellikleri
      1. Verim için yer değiştirme ve akma noktasına kadar yer değiştirmeyi veya gerinim değerlerini temsil eden değerler. Bunları bulmak için, adım 8.3.2'de açıklandığı gibi verimi bulun.
      2. Toplam yer değiştirme ve toplam gerinim değerleri, bir numunenin test boyunca deneyimlediği toplam yer değiştirmeyi veya toplam gerinim değerini temsil eder ve başarısızlık noktasına karşılık gelir.
      3. Verim sonrası yer değiştirme ve akma sonrası gerinim: Verim sonrası yer değiştirme yaygın olarak rapor edilir ve toplam yer değiştirmeden verime yer değiştirmenin çıkarılmasıyla hesaplanabilir. Toplam gerinimden verime gerinim çıkararak akma sonrası gerinim hesaplayın, ancak gerinim ilk olarak malzemenin doğrusal elastik olduğu varsayımı altında türetildiğinden (ön akma) bunu dikkatli bir şekilde bildirin. Bu, verim sonrası bir önlemi geçersizliğe duyarlı hale getirir.
   5. Enerji özellikleri
      1. Enerjiyi, kuvvet-yer değiştirme veya gerilim-gerinim eğrisinin altındaki alan olarak hesaplayın.
      2. Kuvvet-yer değiştirme eğrisinin altındaki alan iş olarak bilinir. Eğrinin ön akma kısmı veya elastik bölge altında hesaplanan alan, elastik iş veya enerji olarak bilinir. Akma noktasını geçen eğrinin altında hesaplanan alan veya plastik bölge, akma sonrası veya plastik iş veya kayıp enerji olarak bilinir.
      3. Gerilim-gerinim eğrisi altında hesaplanan toplam alan, tokluk veya tokluk modülü olarak bilinirken, gerilim-gerinim eğrisi altında akma noktasına kadar hesaplanan alan esneklik olarak bilinir. Akma sonrası gerinim gibi, akma sonrası tokluk, bu özelliğin altına girmediği gerinim denklemlerinin varsayımları nedeniyle genellikle rapor edilmez.

Şekil 3: Kuvvet-yer değiştirme ve gerilim-gerinim eğrileri. (A) İdeal kuvvet-yer değiştirme eğrisi; (B) kırmızı ile gösterilen akma noktasını hesaplamak için kullanılan %0,2 ofset yönteminden türetilen çizgi ile ideal gerilim-gerinim eğrisi (bu çizginin eğrinin elastik bölgesininkiyle aynı eğime sahip olduğuna dikkat edin). Kuvvet-yer değiştirme eğrisinden elde edilebilecek temel özellikler arasında akma kuvveti, nihai kuvvet, yer değiştirmeden verime, toplam yer değiştirme ve iş bulunur. Gerilim-gerinim eğrisinden elde edilebilecek doku seviyesi özellikleri arasında akma gerilimi, nihai gerilim, gerinim-verim, toplam gerinim, esneklik ve tokluk bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

BT taramasının tamamlanmasının ardından, yetersiz taramaların çoğu rekonstrüksiyonda yakalanabilir. Genellikle, zayıf taramalar, tarama sırasındaki bir hatanın açık bir göstergesi olan yüksek bir yanlış hizalama telafisine sahip olacaktır. Ancak, diğer adımlarda hatalar oluşabilir ve yanlış verilere de yol açabilir. Bu hatalar genellikle tek tek hesaplanan mimari özellikler incelenirken fark edilebilir. Değerler bir gruptaki diğer değerlerin aralığının çok dışında kalıyorsa, tarama,...

Tartışmalar

Tarama ve test süreci boyunca, sorun giderme ve optimizasyonun uygun olduğu anlar vardır. Bunlardan ilki, μCT kullanarak kemikleri tararken ortaya çıkar. Birçok sistem, bir nesnenin tutulabileceği ve taranabileceği bir tutucu ile birlikte gelirken, aynı anda birden fazla kemiği taramak için özel tutucular üretilebilir. Birden fazla kemiğin taranması optimizasyon için mükemmel bir nokta olabilir, ancak artefaktların indüklenmediğinden emin olmak için tarama ve analiz süreci boyunca dikkatli olunmal?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object