Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Özet

Burada, insan limbal niş hücrelerini izole etmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Burada limbal niş hücrelerin (LNC'ler) izolasyonu ve tanımlanması için standart bir prosedür sunuyoruz. LNC'lerin izolasyonu için göz bankasından elde edilen limbus dokusu kullanıldı. Doku, aseptik koşullar altında 12 parçaya bölündü ve LNC'ler ve limbal epitelyal progenitör hücreler ile hücre kümeleri elde etmek için kollajenaz A kullanılarak hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 18 saat sindirildi. Hücre kümeleri, tek hücreler elde etmek için% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 37 ° C'de 15 dakika boyunca sindirildi ve daha sonra% 5 Matrigel ile kaplanmış plastik bir yüzey üzerinde modifiye embriyonik kök hücre ortamında (MESCM) kültürlendi. Hücreler %70 birleşme üzerine geçirildi ve LNC'ler immünofloresan, gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ve akış sitometrisi kullanılarak tanımlandı. Birincil LNC'ler izole edildi ve 12 defadan fazla geçti. LNC'lerin P4'ten P6'ya proliferasyon aktivitesi en yüksekti. LNC'ler, BMMSC'lerden (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ve PDGFRβ) daha yüksek kök hücre belirteçleri ifade etti. Ayrıca, sonuçlar, P4 LNC'lerin VIM, CD90, CD105 ve PDGFRβ'yi tekdüze olarak eksprese ettiğini, ancak LNC'lerin tanımlanması için bir belirteç olarak kullanılabilecek Pan-CK'yi eksprese etmediğini gösterdi. Akış sitometrik analizi, LNC'lerin yaklaşık %95, %97, %92 ve %11'inin sırasıyla CD73, CD90, CD105 ve SCF eksprese ettiğini, BMMSC'lerde ise %68, %99, %20 ve %3 olduğunu gösterdi. LNC izolasyonu ve tanımlanması için standart süreç, LNC'lerin yaygın kullanımı için güvenilir bir laboratuvar temeli sağlayabilir.

Giriş

Limbal kök hücre eksikliği (LSCD)¹ olarak da adlandırılan kornea epitelyal kök hücre eksikliği (CESD) ve kornea epitel rejenerasyonu (CES) insidansı, kornea enfeksiyonu ve yaralanması nedeniyle giderek daha acil hale gelmektedir. Uygun şekilde tedavi edilmezse, CESD kornea nakli gerektiren körlüğe yol açabilir. Sonuç olarak, CES rejenerasyonu daha önemli hale geliyor. CES işlevi için gerekli desteği sağlayan limbal niş hücreler (LNC'ler) adı verilen bir grup destekleyici hücre vardır. Limbal stromal kök hücreler ilk olarak Polisetty ve ^ark.2 tarafından izole edilmiş ve Xie ve ^ark.3 tarafından limb....

Protokol

50 ila 60 yaşları arasındaki donörlerden alınan limbus dokusu, Tongji Hastanesi (Wuhan, Çin) Kızıl Haç Göz Bankası'ndan elde edildi. Protokol, Tongji Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü.

1. İzolasyon

1. Orta süreli kornea depolama ortamından limbus dokusu elde edin ve ultra temiz bir tezgah üzerinde aseptik koşullar altında çalıştırın.
2. Steril bir cerrahi yuvarlak bıçak kullanarak korneanın etrafındaki iris ve endotelyumu kazıyın ve çıkarın.
3. Kornea ve skleranın her iki tarafında 1 mm kalacak şekilde cerrahi bir bıçakla limbus dokusunu eşit büyüklükte ....

Tartışmalar

Kornea şeffaflığı tipik olarak, normal görme keskinliği için çok önemli olan kornea stromasındaki küçük liflerin (25-30 nm çapında) düzenli olarak düzenlenmesi ve dağıtılmasıyla sağlanır¹⁶. Dünyada 36 milyonu kör olmak üzere 253 milyon görme engelli^{insan var 17}. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), kornea körlüğünü insan görme duyusuna yönelik en ciddi tehlikelerden biri olarak kabul etmektedir ve dünya çapındaki tüm körlüklerin %5,1'ini .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100