Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.

Özet

Sipunculus nudus'un (sFE) fibrinolitik enzimi, hem plazminojeni plazmine aktive edebilen hem de fibrini doğrudan parçalayabilen, geleneksel trombolitik ajanlara göre büyük avantajlar gösteren yeni bir fibrinolitik ajandır. Bununla birlikte, yapısal bilgi eksikliği nedeniyle, sFE için tüm saflaştırma programları, çok karmaşık ve maliyetli olan çok adımlı kromatografi saflaştırmalarına dayanmaktadır. Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez sFE'nin bir afinite saflaştırma protokolü geliştirilmiştir; ham numunenin hazırlanmasını ve lizin/arginin-agaroz matrisi afinite kromatografisi kolonunu, afinite saflaştırmasını ve saflaştırılmış sFE'nin karakterizasyonunu içerir. Bu protokolü takiben, bir grup sFE 1 gün içinde saflaştırılabilir. Ayrıca, saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve aktivitesi sırasıyla% 92 ve 19.200 U / mL'ye yükselir. Bu nedenle, bu sFE saflaştırması için basit, ucuz ve verimli bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, sFE ve diğer benzer ajanların daha fazla kullanımı için büyük önem taşımaktadır.

Giriş

Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi 1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA'lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu 3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğrudan çözebilen ancak çeşitli plazmin inhibitörleri tarafından hızla inaktive edilen plazmin gibi fibrinolitik enzimleri (FE) de içeren başka bir klinik trombolitik ilaç türüdür5. Daha sonra, sadece plazminojeni plazmine aktive etmekle kalmayıp, aynı zamanda eski fıstık solucanı Sipunculus nudus'tan (sFE) 6 fibrinolitik enzim olan fibrinidoğrudan parçalayarak trombüsü çözebilen yeni bir fibrinolitik ajan türü bildirilmiştir. Bu çift fonksiyonlu sFE'ye geleneksel trombolitik ilaçlara göre, özellikle anormal plazminojen durumu açısından başka avantajlar sağlar. Diğer iki fonksiyonlu fibrinolitik ajanlarla karşılaştırıldığında 7,8,9, sFE, özellikle oral ilaçlar için, ilaç geliştirme için gıda dışı türetilmiş ajanlara göre güvenlik de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar göstermektedir. Bunun nedeni, Sipunculus nudus'un biyogüvenliği ve biyouyumluluğunun iyi kurulmuş olmasıdır10.

Mikroorganizmalardan, solucanlardan ve mantarlardan izole edilen diğer doğal fibrinolitik ajanlara benzer şekilde, sFE'nin S. nudus'tan saflaştırılması çok karmaşıktır ve doku homojenizasyonu, amonyum sülfat çökeltmesi, tuzdan arındırma, anyon değişim kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve moleküler eleme gibi çoklu aşamaları içerir10,11,12. Böyle bir saflaştırma sistemi sadece yetkin becerilere ve pahalı malzemelere bağlı değildir, aynı zamanda tüm prosedürü tamamlamak için birkaç gün gerektirir. Bu nedenle, sFE'nin basit bir saflaştırma programı, sFE'nin daha da geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Neyse ki, iki kristal sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) başarıyla elde edilmiştir (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Yapısal analiz ve moleküler yerleştirme deneyleri sayesinde, sFE'nin katalitik çekirdeğinin özellikle arginin veya lizin kalıntıları içeren hedeflere bağlanabileceğini bulduk.

Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez bir afinite arıtma sistemi önerilmiştir. Bu protokolü izleyerek, son derece saf ve oldukça aktif sFE, tek bir afinite saflaştırma aşamasında ham ekstraktlardan saflaştırılabilir. Burada geliştirilen protokol sadece sFE'nin büyük ölçekli hazırlanması için önemli değildir, aynı zamanda diğer fibrinolitik ajanların saflaştırılması için de uygulanabilir.

Protokol

1. Hazırlık

  1. Numune tedavisi
    1. Taze S. nudus'u (100 g) dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ve iç sıvısını toplayın.
    2. Homojenizasyon (1.000 rpm, 60 sn) için 300 mL Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 7,4) ekleyin.
    3. Homojenatı 3x dondurarak çözün.
    4. Numuneyi santrifüj edin (10.956 × g, 0,5 saat, 4 °C) ve süpernatanı toplayın. Numuneyi daha sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Protein çökeltmesi
    1. Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve daha sonra devam edilebilir.
    2. Protein çökeltisini elde etmek için santrifüj (10.956 × g, 0.5 h, 4 °C); Daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
  3. Protein resüspansiyonu
    1. Protein çökeltisini 30 mL Tris-HCl tamponu (0.02 M, pH 7.4) ile yeniden askıya alın. Bu ham protein çözeltisini daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.

2. Afinite kromatografisi

  1. Çözelti filtrasyonu
    1. Ham protein çözeltisini 0,22 μm'lik bir filtre membranından filtreleyin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
  2. Kolon paketleme
    1. Arjinin-agaroz matris afinite kromatografi kolonu ve lizin-agaroz matris afinite kromatografisi kolonunu, uygun miktarda lizin-agaroz matriks ortamı ve arginin-agaroz matriks ortamını 5 mL boş kromatografi kolonuna yükleyerek paketleyin.
      NOT: Kolon 2-8 °C'de, matris mağaza tamponuna (%20 etanol) daldırılarak saklanabilir.
  3. Afinite saflaştırma
    1. Afinite kromatografisi kolonunu önce ddH2O (1 mL/dak, 10 sütun hacmi), ardından Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/dak, 5 sütun hacmi) ile dengeleyin.
    2. Protein çözeltisi numunesini önceden dengelenmiş kolona yükleyin (1 mL/dak, 1/3 sütun hacmi).
      NOT: Numune yükleme hacmi, sFE konsantrasyonuna bağlıdır.
    3. Kolonu Tris-HCl tamponu ile yıkayın (0,02 M, pH 8,0, beş sütun hacmi).
    4. Kolonu sırasıyla 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M ve 0,65 M NaCl (1 mL/dak, beş sütun hacmi) ile kaldırın.
    5. 0.15 M NaCl elüsyonunda görünmesi gereken elüsyon tepesini arayın ve ardından fraksiyonları 5 mL tüplerde toplayın.
    6. Elüsyon numunesini 3 kD ultra santrifüj filtre (3.944 × g, 1,5 saat, 4 °C) kullanarak konsantre edin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

3. Saflık değerlendirmesi

  1. Sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel preparatı
    1. SDS-PAGE jeli, %5 konsantre jel ve %12 ayırma jeli13 kullanarak Laemmli'nin yöntemine göre hazırlayın.
  2. Elektroforez
    1. Numuneyi (15 μL) 5x SDS-PAGE protein yükleme tamponu (1/4 hacim) ile karıştırın, kaynar suda 5 dakika ısıtın, SDS-PAGE jeline yükleyin ve jeli 80 V, 60 mA'da 1,5 saat boyunca çalıştırın.
  3. Analiz
    1. Elektroforezden sonra, jeli üreticinin protokolüne göre bir Gümüş Leke Kiti ile lekeleyin ve kemilüminesan görüntüleme sistemi kullanarak lekeli jeli gözlemleyin.
    2. Aşağıdaki formülü kullanarak hedef proteinin saflığını analiz edin: hedef proteinin saflığı = hedef proteinin yoğunluk değeri / toplam proteinin yoğunluk değeri.

4. Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi

  1. Fibrin plaka hazırlama
    1. 25 mg fibrinojen çözeltisini 1.25 mL fizyolojik salin ile karıştırarak hazırlayın.
    2. 100 U trombini 1.05 mL fizyolojik salin ile tamamen karıştırarak trombin çözeltisini hazırlayın.
    3. 22.5 mL Tris-HCl tamponuna (0.02 mol / L, pH 7.4) 0.5 g agaroz ekleyerek agaroz çözeltisini hazırlayın. Agaroz çözeltisini karıştırın ve tamamen çözünene kadar 100 ° C'de ısıtın.
    4. Agaroz çözeltisini yaklaşık 50 ° C'ye kadar soğutun ve fibrinojen çözeltisi ekleyin. Ardından, hemen trombin çözeltisini ekleyin, hızlıca karıştırın ve 60 mm'lik bir kültür kabına dökün.
  2. Yükleme
    1. Steril bir delici kullanarak hazırlanan fibrin plakalara 3 mm'lik kuyular delin ve kuyucukları 10 μL numunelerle doldurun.
  3. Analiz
    1. 37 ° C'de 18 saatlik inkübasyondan sonra, bozunma bölgelerinin boyutunu hesaplayarak fibrinolitik aktiviteyi ölçün. Fibrinolitik aktivite = (numunenin bölge büyüklüğü / ürokinazın bölge boyutu) x 100 U. Bölge boyutu = çap x çap.
      NOT: Fizyolojik salin tamponu, ham protein (protokol adım 1.3.1'de elde edilen örnek) ve ürokinaz sırasıyla boş, negatif kontrol ve pozitif kontrol için kullanılmıştır. Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk.

Sonuçlar

Bu protokolü takiben, ham doku lizatları ekstrakte edildi, arginin-agaroz matriksi ve lizin-agaroz matriks afinite kromatografisi kolonları oluşturuldu, saflaştırılmış sFE elde edildi ve saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve fibrinolitik aktivitesi sırasıyla SDS-PAGE ve fibrin plakaları ile ölçüldü.

Santrifüjlemeden sonra, toplanan süpernatant şeffaf bronz viskoz bir sıvıydı. Yağış, bu süpernatant doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırı...

Tartışmalar

sFE'nin tam gen dizisinin bulunamaması nedeniyle, şu anda kullanılan sFE, taze S. nudus14'ten ekstrakte edildi. Ayrıca, literatürde bildirilen sFE'nin saflaştırma prosedürleri, moleküler ağırlık, izoelektrik nokta, iyonik mukavemet ve polarite15,16 gibi sFE'nin bazı genel özelliklerine dayandığı için karmaşık ve maliyetliydi. Bugüne kadar sFE'nin afinite saflaştırma protokolü bildirilmemiştir. Bu çalışm...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)Biosharp
2-MercaptoethanolSolarbio
Agarose G-10Biowest
Ammonium persulfateSINOPHARM
Ammonium sulfateSINOPHARM
Arginine-Sepharose 4BSolarbioArginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)Solarbio
Fast Silver Stain KitBeyotime
FibrinogenMerck
GlycineSolarbio
Hydrochloric acidSINOPHARM
KinaseRHAWN
Lysine-Sepharose 4BSolarbioLysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)Beyotime
Sodium chlorideSINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)Sigma-Aldrich
Sodium hydroxideSINOPHARM
ThrombinMeilunbio
Tris(Hydroxymethyl) AminomethaneSolarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane HydrochlorideSolarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pureGE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750SANYO
Chemiluminescence Imaging SystemGE
Constant Flow Pump BT-100QITE
Constant Temperature IncubatorJINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KSSIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140ADSENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-IISCIENTZ
Electronic Analytical BalanceDENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12SENXIN
Horizontal Decolorization ShakerKylin-Bell
Ice Machine AF 103Scotsman
KQ-500E Ultrasonic CleanerShuMei
Magnetic StirrerZhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-WCence
Microwave OvenGalanz
Milli-Q ReferenceMillipore
PipettorThermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH MeterSartorious
Small-sized Vortex OscillatorKylin-Bell
Vertical Electrophoresis SystemBio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL)Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)NEST
Centrifuge Tube (7 mL)Biosharp
Culture Dish (60 mm)NEST
Filter Membrane (0.22 µm)Millex GP
ParafilmBemis
Pipette Tip (1 mL )KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)Axygene
Pipette Tip (200 µL)Axygene
Special Indicator PaperTZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)Millipore
Universal pH IndicatorSSS Reagent

Referanslar

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
  11. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır