Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Özet

Burada, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.

Özet

Sipunculus nudus'un (sFE) fibrinolitik enzimi, hem plazminojeni plazmine aktive edebilen hem de fibrini doğrudan parçalayabilen, geleneksel trombolitik ajanlara göre büyük avantajlar gösteren yeni bir fibrinolitik ajandır. Bununla birlikte, yapısal bilgi eksikliği nedeniyle, sFE için tüm saflaştırma programları, çok karmaşık ve maliyetli olan çok adımlı kromatografi saflaştırmalarına dayanmaktadır. Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez sFE'nin bir afinite saflaştırma protokolü geliştirilmiştir; ham numunenin hazırlanmasını ve lizin/arginin-agaroz matrisi afinite kromatografisi kolonunu, afinite saflaştırmasını ve saflaştırılmış sFE'nin karakterizasyonunu içerir. Bu protokolü takiben, bir grup sFE 1 gün içinde saflaştırılabilir. Ayrıca, saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve aktivitesi sırasıyla% 92 ve 19.200 U / mL'ye yükselir. Bu nedenle, bu sFE saflaştırması için basit, ucuz ve verimli bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, sFE ve diğer benzer ajanların daha fazla kullanımı için büyük önem taşımaktadır.

Giriş

Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi ^1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA'lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu ^3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğruda....

Protokol

1. Hazırlık

1. Numune tedavisi
   1. Taze S. nudus'u (100 g) dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ve iç sıvısını toplayın.
   2. Homojenizasyon (1.000 rpm, 60 sn) için 300 mL Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 7,4) ekleyin.
   3. Homojenatı 3x dondurarak çözün.
   4. Numuneyi santrifüj edin (10.956 × g, 0,5 saat, 4 °C) ve süpernatanı toplayın. Numuneyi daha sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
2. Protein çökeltmesi
   1. Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve dah....

Tartışmalar

sFE'nin tam gen dizisinin bulunamaması nedeniyle, şu anda kullanılan sFE, taze S. nudus^14'ten ekstrakte edildi. Ayrıca, literatürde bildirilen sFE'nin saflaştırma prosedürleri, moleküler ağırlık, izoelektrik nokta, iyonik mukavemet ve polarite^15,16 gibi sFE'nin bazı genel özelliklerine dayandığı için karmaşık ve maliyetliydi. Bugüne kadar sFE'nin afinite saflaştırma protokolü bildirilmemiştir. Bu çalışm.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent