MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

Özet

Mevcut protokol, MCF-7 hücre proliferasyonunu ve göçünü inhibe etmede salidrosidin farmakolojik etkisini ve mekanizmasını değerlendirmek için kapsamlı bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Özet

Salidrosid (Sal), anti-kanserojen, anti-hipoksik ve anti-inflamatuar farmakolojik aktiviteler içerir. Bununla birlikte, altta yatan anti-meme kanseri mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, bu protokol, insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunda PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu düzenlemede Sal'ın potansiyelini çözmeyi amaçladı. İlk olarak, Sal'ın MCF-7'ye karşı farmakolojik aktivitesi CCK-8 ve hücre çizik testleri ile değerlendirildi. Ayrıca, MCF-7 hücrelerinin direnci migrasyon ve Matrigel invazyon testleri ile ölçüldü. Hücre apoptozu ve siklus tahlilleri için, MCF-7 hücreleri, akış sitometrisi analizleri için sırasıyla annexin V-FITC/PI ve hücre döngüsü boyama tespit kitleri ile adım adım işlendi. Reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca²⁺ düzeyleri DCFH-DA ve Fluo-4 immünofloresan boyama ile incelendi. Na+-K⁺-ATPaz ve^Ca2+-ATPaz aktiviteleri, ilgili ticari kitler kullanılarak belirlendi. Apoptozdaki protein ve gen ekspresyon seviyeleri ve PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolağı sırasıyla western blot ve qRT-PCR analizleri kullanılarak belirlendi. Sal tedavisinin, doza bağlı etkilerle MCF-7 hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve invazyonunu önemli ölçüde kısıtladığını bulduk. Bu arada, Sal uygulaması ayrıca MCF-7 hücrelerini apoptoz ve hücre döngüsü durmasına maruz kalmaya zorladı. İmmünofloresan testleri, Sal'ın MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2⁺ üretimini gözle görülür şekilde uyardığını gösterdi. Diğer veriler, Sal'ın pro-apoptotik proteinlerin, Bax, Bim, bölünmüş kaspaz-9/7/3 ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyon seviyelerini desteklediğini doğruladı. Tutarlı bir şekilde, Sal müdahalesi Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α ve FoxO1 proteinlerinin ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyonunu belirgin şekilde azalttı. Sonuç olarak, Sal, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu inhibe ederek MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu, göçünü ve istilasını azaltabileceğinden, meme kanserini tedavi etmek için potansiyel bir bitki türevi bileşik olarak kullanılabilir.

Giriş

En sık teşhis edilen kanserlerden ve en yaygın malignitelerden biri olan son istatistikler, 2020 yılına kadar dünya çapında 2,3 milyon meme kanseri vakasının ortaya çıktığını ve tüm kanser vakalarının %11,7'sini oluşturduğunu göstermektedir¹. Meme kanserinin yaygın semptomları arasında memede hassasiyet ve karıncalanma, memede yumrular ve ağrı, meme başı akıntısı, erozyon veya çökük cilt ve genişlemiş koltuk altı lenf düğümleri^{bulunur 1,2}. Daha da endişe verici olanı, yeni vakaların sayısı ve genel meme kanseri insidansı her yıl ezici bir oranda artmaya devam ediyor ve kansere bağlı ölü....

Protokol

Bu çalışma için kullanılan MCF-7 hücreleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Hücre kültürü

1. MCF-7 hücrelerini, %10 FBS ve %1 penisilin (10.000 U/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) içeren DMEM ile 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Deneyin için çanağın tabanının %90'ını kaplayan hücreler kullanıldı ve aşağıdaki gruplara ayrıldı: kontrol grubu, doksorubisin hidroklorür grubu (DXR, 5 μM) ve Sal grupları (20 μM, 40 μM ve 80 μM) veya kontrol grubu, LY294002 (10 μM, bir PI3K inhibitörü) grubu, Sal (80 μM) grub....

Tartışmalar

Meme kanseri her yaştan bireyi etkilemekte ve hesaplanamayan fiziksel ve zihinsel yüke ve büyük ekonomik baskıya neden olmaktadır¹. Meme kanseri, her geçen yıl artan morbidite ve mortalitesi ile konvansiyonel tedavilerin ötesinde etkili bitkisel bazlı bileşik tedaviler arayışı açısından da dünya çapında ilgi görmektedir ^4,5. Umut verici bir şekilde, çok sayıda kanıt Sal ^24,25,38'in

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018