JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, MCF-7 hücre proliferasyonunu ve göçünü inhibe etmede salidrosidin farmakolojik etkisini ve mekanizmasını değerlendirmek için kapsamlı bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Özet

Salidrosid (Sal), anti-kanserojen, anti-hipoksik ve anti-inflamatuar farmakolojik aktiviteler içerir. Bununla birlikte, altta yatan anti-meme kanseri mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, bu protokol, insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunda PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu düzenlemede Sal'ın potansiyelini çözmeyi amaçladı. İlk olarak, Sal'ın MCF-7'ye karşı farmakolojik aktivitesi CCK-8 ve hücre çizik testleri ile değerlendirildi. Ayrıca, MCF-7 hücrelerinin direnci migrasyon ve Matrigel invazyon testleri ile ölçüldü. Hücre apoptozu ve siklus tahlilleri için, MCF-7 hücreleri, akış sitometrisi analizleri için sırasıyla annexin V-FITC/PI ve hücre döngüsü boyama tespit kitleri ile adım adım işlendi. Reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2+ düzeyleri DCFH-DA ve Fluo-4 immünofloresan boyama ile incelendi. Na+-K+-ATPaz veCa2+-ATPaz aktiviteleri, ilgili ticari kitler kullanılarak belirlendi. Apoptozdaki protein ve gen ekspresyon seviyeleri ve PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolağı sırasıyla western blot ve qRT-PCR analizleri kullanılarak belirlendi. Sal tedavisinin, doza bağlı etkilerle MCF-7 hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve invazyonunu önemli ölçüde kısıtladığını bulduk. Bu arada, Sal uygulaması ayrıca MCF-7 hücrelerini apoptoz ve hücre döngüsü durmasına maruz kalmaya zorladı. İmmünofloresan testleri, Sal'ın MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2+ üretimini gözle görülür şekilde uyardığını gösterdi. Diğer veriler, Sal'ın pro-apoptotik proteinlerin, Bax, Bim, bölünmüş kaspaz-9/7/3 ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyon seviyelerini desteklediğini doğruladı. Tutarlı bir şekilde, Sal müdahalesi Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α ve FoxO1 proteinlerinin ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyonunu belirgin şekilde azalttı. Sonuç olarak, Sal, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu inhibe ederek MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu, göçünü ve istilasını azaltabileceğinden, meme kanserini tedavi etmek için potansiyel bir bitki türevi bileşik olarak kullanılabilir.

Giriş

En sık teşhis edilen kanserlerden ve en yaygın malignitelerden biri olan son istatistikler, 2020 yılına kadar dünya çapında 2,3 milyon meme kanseri vakasının ortaya çıktığını ve tüm kanser vakalarının %11,7'sini oluşturduğunu göstermektedir1. Meme kanserinin yaygın semptomları arasında memede hassasiyet ve karıncalanma, memede yumrular ve ağrı, meme başı akıntısı, erozyon veya çökük cilt ve genişlemiş koltuk altı lenf düğümleribulunur 1,2. Daha da endişe verici olanı, yeni vakaların sayısı ve genel meme kanseri insidansı her yıl ezici bir oranda artmaya devam ediyor ve kansere bağlı ölümlerin %6,9'unu oluşturuyor1. Şu anda, meme kanseri müdahalesi hala esas olarak kemoterapi, cerrahi, radyoterapi ve kapsamlı tedaviyi içermektedir. Tedavi, hastaların nüks oranını ve mortalite oranını etkili bir şekilde azaltabilse de, uzun süreli tedavi uygulaması sıklıkla çoklu ilaç direncine, geniş alan saç dökülmesine, bulantı ve kusmaya ve ciddi zihinsel ve psikolojik yüke neden olur 2,3. Özellikle, meme kanserinden kaynaklanan çoklu organ metastazı riski, insanları yeni bitkisel ilaç tedavisi kaynakları aramaya zorlamaktadır 4,5.

Fosfoinositid 3 kinaz (PI3K) aracılı sinyalleme, çoklu genlerin ekspresyonunu etkileyen ekleme yoluyla meme kanserinin büyümesi, çoğalması ve hayatta kalmasındarol oynar 6. PI3K'nın aşağı akış sinyal algılayıcı bir proteini olarak, çok sayıda kanıt, protein kinaz B'nin (AKT) meme kanserini daha da artırmak için memeli rapamisin (mTOR) proteini hedefi ile birleşebileceğini düşündürmektedir 7,8,9. Ayrıca, PI3K/AKT/mTOR sinyalinin devre dışı bırakılmasının, meme kanserinde malign proliferasyonu inhibe eden ve apoptozu uyaran ilaçlarda da önemli bir bileşen olduğu iddia edilmiştir10,11,12. Tümör mikroçevresindeki aşırı hipoksin, hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 alfa'da (HIF-1α) büyük bir artışa neden olduğu ve bu da meme kanserinin ilerlemesini daha da kötüleştirdiğiiyi bilinmektedir 13,14,15. Buna paralel olarak, AKT stimülasyonu da aşırı HIF-1α birikimine yol açarak meme kanseri örneklerinde apoptozu sınırlar16,17. İlginç bir şekilde, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin aktivasyonunun, akciğer kanseri18, kolorektal kanser19, yumurtalık kanseri 20 ve prostat kanseri21 dahil olmak üzere çeşitli kanserlerde patolojik ilerleme ve metastazda rol oynadığı doğrulanmıştır. HIF-1α tarafından düzenlenmesine ek olarak, çatallı kafa transkripsiyon faktörü 1 (FoxO1) aşırı ekspresyonu, meme kanseri hücrelerinde döngü durmasını ve apoptozun inhibisyonunu destekleyen AKT sinyal stimülasyonu tarafından da tetiklenir22,23. Birlikte, yukarıdaki sağlam kanıtlar, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalinin kaskadının inhibisyonunun meme kanserinde ilaç tedavisi için potansiyel yeni bir hedef olabileceğini düşündürmektedir.

Salidrosidin (Sal) anti-kanser24,25, anti-hipoksi 26,27,28,29 ve bağışıklık arttırıcı farmakolojik aktiviteler30 uyguladığı yaygın olarak gösterilmiştir. Suda kolayca çözünebilen, bir tür feniletilanoid glikozit olan ve kimyasal yapı formülüC14H20O7ve moleküler ağırlığı 300.331,32 olan açık kahverengi veya kahverengi bir tozdur. Modern farmakolojik araştırmalar, Sal'ın PI3K-AKT-mTOR sinyalini24 kısıtlayarak mide kanseri hücrelerinin apoptozunu destekleyebileceğini göstermiştir. Daha fazla kanıt ayrıca, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin Sal tedavisi ile baskılanmasının, kemoterapötik ajanlara duyarlılıklarını artırarak kanser hücrelerinin apoptozuna katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir25. Kanıtlar ayrıca Sal'ın hücre göçünü ve istilasını kısıtladığını ve insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinde apoptozu teşvik ederek döngü durmasına neden olduğunu göstermektedir33,34. Bununla birlikte, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalini düzenleyip düzenleyemeyeceği ve MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu inhibe edip edemeyeceği henüz belli değil. Bu nedenle, bu protokol, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolu yoluyla MCF-7 hücre göçü, invazyonu, hücre döngüsü ve apoptoz üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı. Hücre göçü ve invazyon değerlendirmeleri, akış sitometrisi ile apoptoz ve hücre döngüsü tespiti, reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2 + floresan tayini gibi geleneksel, düşük maliyetli ve bağımsız deneyleri içeren entegre araştırma stratejileri, geleneksel bitkisel ilaçlarla anti-kanser araştırmaları için deneylerin genel tasarımı için bir referans sağlayabilir. Bu çalışmanın deneysel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protokol

Bu çalışma için kullanılan MCF-7 hücreleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Hücre kültürü

  1. MCF-7 hücrelerini, %10 FBS ve %1 penisilin (10.000 U/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) içeren DMEM ile 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Deneyin için çanağın tabanının %90'ını kaplayan hücreler kullanıldı ve aşağıdaki gruplara ayrıldı: kontrol grubu, doksorubisin hidroklorür grubu (DXR, 5 μM) ve Sal grupları (20 μM, 40 μM ve 80 μM) veya kontrol grubu, LY294002 (10 μM, bir PI3K inhibitörü) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).

2. Hücre canlılığı testi

NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 27.

  1. 96 oyuklu plakalarda 8 x 104 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip MCF-7 hücrelerini tohumlayın ve hücreler yapışana kadar gece boyunca Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM ve 320 μM) ile inkübe edin veya Sal (20, 40, 80 μM) 12 saat / 24 saat / 36 saat / 48 saat boyunca.
  2. İşlemden sonra, MCF-7 hücrelerini 10 μL / kuyu CCK-8 çözeltisi ile 2 saat boyunca birlikte inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, otomatik bir mikroplaka okuyucu ile optik yoğunluğu 450 nm'de (OD450) ölçün.

3. Hücre göçü ve istilası

NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 35.

  1. Yemeğin tabanının %90'ını kaplayacak şekilde 6 oyuklu plakalara ekilmiş 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücreyi inkübe edin.
  2. Steril bir pipet ucu ile hücre tek tabakasının merkezi boyunca doğrusal bir çizik sarımı gerçekleştirin. 0 saat, 24 saat ve 48 saatte optik mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.
  3. Çizik yaralarının genişliğini ölçmek için Image J yazılımını kullanın.
  4. Transwell testi için, MCF-7 hücrelerini serum ortamı olmadan askıya alın ve Matrigel ile veya Matrigel olmadan önceden kaplanmış üst transwell odasında tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Transwell odasının dibinde, kimyasal bir indükleyici olarak DMEM tam ortamı kullanın. 24 saat sonra, üst odadaki hücreleri çıkarın ve kalan istilacı ve göçmen hücreleri metanol35'e sabitleyin.
  6. MCF-7 hücrelerini kristal viyole solüsyonu ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Optik mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın.

4. Na + - K + -ATPaz ve Ca 2 + - Mg2 + -ATPaz'ın aktivite değerlendirmesi

  1. Üreticinin talimatlarını izleyerek parçalanmış MCF-7 hücrelerindeki protein konsantrasyonunu ölçmek için bir bikinkoninik asit (BCA) kiti kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Parçalanmış hücrelerin örneklerini karşılık gelen gruplarında 96 oyuklu plakalara ekleyin. Bundan sonra, 37 ° C'de 5 dakika inkübe etmek için çalışma solüsyonunu ekleyin. Son olarak, OD636 değerlerini çok işlevli bir mikroplaka okuyucu ile ölçün.

5. Apoptoz ve hücre döngüsünün akış sitometrisi analizi

NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 31.

  1. Hücreleri sindirin ve ekin V-FITC ve propidyum iyodür (PI) ile 20 dakikalık bir boyama için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse etmek için hasat edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bir akış sitometresi kullanarak apoptotik hücrelerin sayısını belirleyin.
  2. Yeniden süspanse edilmiş numune çözeltisini 30 dakikalık bir inkübasyon için PI çözeltisi ile karıştırın, ardından bir akış sitometresi ile tespit edin.

6. DCFH-DA ve Fluo-4 floresan boyama

NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 29.

  1. MCF-7 hücrelerini 37 °C'de 10 μM DCFH-DA floresan probu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 20 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayarak fazla DCFH-DA'yı iyice çıkardıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 525 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluğunu test edin.
  2. MCF-7 hücrelerini 5 μM Fluo-4 floresan prob çözeltisi ile 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 516 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluk değerlerini belirleyin.

7. Batı lekesi

  1. 6 oyuklu plakalara farklı ilaçlar içeren 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 24 saat boyunca 37 °C,% 5CO2 inkübatörde kültürleyin.
    NOT: Western blot analizi için gruplar şu şekilde belirlenmiştir: kontrol grubu, LY294002 (10 μM) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Hücreleri ve süpernatanı toplayın ve 560 × g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve önceden soğutulmuş PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra hücreleri 560 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
  3. 15 dakikalık bir buz banyosu için 7.2. adımdan hücre örneğine 50 μL lizis tamponu ekleyin. Süpernatan protein örneğini toplamak için 8550 × g'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  4. Bir BCA yöntemi kullanarak protein konsantrasyonunu tespit ettikten sonra, protein örneğini adım 7.3'te 4:1 oranında yükleme tamponu ile karıştırın, metal bir banyoda 100 °C'de 10 dakika denatüre edin ve oda sıcaklığına soğutun.
  5. Adım 7.4'ten 20 μg protein numunesi ekleyin, %10 SDS-PAGE kullanarak farklı moleküler ağırlıklara35sahip proteinleri ayırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından 0.22 μm PVDF membranlarına aktarın. % 5 BSA ile blokajdan sonra, membranları karşılık gelen primer antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Aşağıdaki primer antikorların seyreltik konsantrasyonu 1:1.000'dir: bölünmüş kaspaz-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 ve β-aktin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. Ertesi gün, membranları keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Bir ECL kemilüminesan çözeltisi kullanarak membranları geliştirin ve temassız bir kantitatif western blot görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleri yakalayın (Malzeme Tablosuna bakın).

8. qRT-PCR

  1. MCF-7 hücrelerini 3 dakika boyunca 4 ° C'de 560 x g'de toplamak için santrifüjleme yapın ve 5 × 106 hücreye 500 μL tampon RL1 ekleyin. Üfleyin ve hiçbir hücre kütlesi görünmeyene kadar bir pipetle tekrar tekrar karıştırın.
    NOT: Tampon RL1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Adım 8.1'deki hücre homojenatlarını toplama tüpüne gömülü DNA temizleme kolonuna aktarın ve 2 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. DNA temizleme kolonunu çıkarın ve süpernatanı toplama tüpünde tutun.
    NOT: DNA temizleme sütunu ve toplama tüpü, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden ikisidir (Malzeme Tablosuna bakın).
  3. Adım 8.2'den itibaren 500 μL süpernatan için 800 μL tampon RL2 ekleyin ve hafifçe karıştırın.
    NOT: Tampon RL2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan önce 60 mL tampon RL2'ye 120 mL susuz etanol ekleyin.
  4. Adım 8.3'teki karışımın 700 μL'sini toplama tüpüne gömülü yalnızca RNA kolonuna aktarın ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
    NOT: Yalnızca RNA sütunu, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın).
  5. Adım 8.3'ten kalan karışımı işlemek için adım 8.4'ü tekrarlayın.
  6. Yalnızca RNA kolonuna 500 μL tampon RW1 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
    NOT: Tampon RW1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).
  7. Yalnızca RNA kolonuna 700 μL tampon RW2 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ◦C'de 8.550 × g'de santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. Adım 8.7'yi bir kez tekrarlayın.
    NOT: Tampon RW2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).
  8. Yalnızca RNA kolonunu toplama tüpüne geri yerleştirin ve kalan tampon RW2'yi çıkarmak için 8550 × g'de 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
  9. Yalnızca RNA kolonunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 65 ° C'de önceden ısıtılmış 100 μL RNaz içermeyen ddH2O'yu yalnızca RNA sütunu için zarın merkezine damlatın. 25 °C'de 2 dakika bekletin ve RNA çözeltisini 1 dakika boyunca 4 °C'de 8.550 × g'da santrifüjleyerek toplayın.
    NOT: RNaz içermeyen ddH2O, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın).
  10. 4 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL oligo (dT)18 primeri, 1 μL rastgele heksamer primeri, 1 μL gene özgü primer (bakınız Tablo 1), 1 μL enzim karışımı ve 5 μg ekleyin RNA çözeltisi adım 8.9'dan 100 μL 8 tüplü bir şeride yerleştirin. Reaksiyon sistemini 20 μL'ye kadar RNaz içermeyen su ile destekleyin.
  11. Sistemin reaksiyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: (1): 95 °C, 30 s, 1 döngü; (2): 95 °C, 5 sn, 50 döngü, 60 °C, 34 sn; (3): 95 °C, 5 sn, 1 döngü, 65 °C, 60 sn, 97 °C, 1 sn; ve (4): 42 °C, 30 sn, 1 döngü. qRT-PCR prosedürünü yürütün.
    NOT: Hedef genlerin nispi ekspresyon seviyeleri 2−ΔΔCT yöntemi36,37 ile kantitatif olarak analiz edildi. qRT-PCR analizi için kullanılan her bir genin primer bilgisi Tablo 1'de listelenmiştir.

9. İstatistiksel analiz

  1. Verileri, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapması olarak ifade edin.
  2. Grafik ve analiz yazılımı kullanarak birden fazla grup arasındaki karşılaştırmaları analiz edin (Malzeme Tablosuna bakınız) tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından bir Tukey testi ile. Bu çalışmada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlanmıştır.

Sonuçlar

Sal'ın MCF-7 hücrelerinde aşırı proliferasyonu inhibe etme ve yara iyileşmesini geciktirme üzerindeki etkileri
Sal'ın meme kanserine karşı potansiyelini araştırmak için, ilk önce insan meme kanseri MCF-7 hücre hattının hücre proliferasyon toksisitesi ve çizik testlerini kullanarak antikanser özelliklerini test ettik. Bu hücreler, 24 saat boyunca bir Sal konsantrasyon serisi (5-320 μM) ile birlikte inkübe edildi ve hücre proliferasyonu bir CCK-8 testi kullanılarak değerlendiri...

Tartışmalar

Meme kanseri her yaştan bireyi etkilemekte ve hesaplanamayan fiziksel ve zihinsel yüke ve büyük ekonomik baskıya neden olmaktadır1. Meme kanseri, her geçen yıl artan morbidite ve mortalitesi ile konvansiyonel tedavilerin ötesinde etkili bitkisel bazlı bileşik tedaviler arayışı açısından da dünya çapında ilgi görmektedir 4,5. Umut verici bir şekilde, çok sayıda kanıt Sal 24,25,38'in

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Sichuan Eyaleti Sağlık Komisyonu (120025) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-1956
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

Referanslar

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T k r kFarmakolojik EtkiMolek ler MekanizmaMCF 7 H cre Proliferasyonunu nhibe EtmeMCF 7 H cre Migrasyonunu nhibe EtmeAnti kanserojenAnti hipoksikAnti inflamatuarPI3K AKT HIF 1 FoxO1 YolaCCK 8 TestiH cre izik TestiMigrasyon TestiMatrigel nvazyon TestiH cre Apoptoz TestiH cre D ng s TestiReaktif Oksijen T rleri ROSCa2Na K ATPaz AktivitesiCa2 ATPaz AktivitesiProtein Ekspresyon SeviyeleriGen Ekspresyon SeviyeleriWestern Blot AnaliziQRT PCR Analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır