Göz Merceğinin Korteks ve Çekirdeğinden Demetlerin ve Tek Fiber Hücrelerin Hazırlanması ve İmmünofloresan Boyanması

Özet

Bu protokol, karmaşık hücreden hücreye interdigitasyonları ve membran mimarisini incelemek için periferik, olgun ve nükleer göz merceği fiber hücrelerini immünofloresan boyama için hazırlama yöntemlerini açıklar.

Özet

Lens, gözün ön kamarasında bulunan ve net bir görüntü oluşturmak için ışığı retinaya ince bir şekilde odaklamak için şekil değiştiren şeffaf ve elipsoid bir organdır. Bu dokunun büyük kısmı, altıgen bir kesite sahip olan ve lensin ön kutuplarından arka kutuplarına kadar uzanan özel, farklılaşmış lif hücrelerinden oluşur. Bu uzun ve sıska hücreler, komşu hücrelere sıkı sıkıya karşıdır ve hücrenin uzunluğu boyunca karmaşık iç içe geçmelere sahiptir. Özel birbirine kenetlenme yapıları, lensin normal biyomekanik özellikleri için gereklidir ve elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Bu protokol, bu karmaşık şekilli hücreler içindeki proteinlerin ayrıntılı lokalizasyonuna izin vermek için tekil ve fare lens lifi hücrelerinin demetlerini korumak ve immün boyamak için ilk yöntemi gösterir. Temsili veriler, merceğin tüm bölgelerinde periferik, farklılaşan, olgun ve nükleer fiber hücrelerin boyandığını gösterir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer türlerin lenslerinden izole edilen lif hücrelerinde kullanılabilir.

Giriş

Lens, gözün ön kamarasında epitelyal ve lif hücreleri 1 olmak üzere iki hücre tipinden oluşan şeffaf ve oval bir dokudur (Şekil 1). Lensin ön hemisferini kaplayan tek bir epitel hücresi tabakası vardır. Fiber hücreler epitel hücrelerinden ayrılır ve lensin büyük kısmını oluşturur. Son derece özelleşmiş lif hücreleri, lens çevresinden lens merkezine^kadar hücre zarı morfolojisinde belirgin değişikliklerle işaretlenmiş bir uzama, farklılaşma ve olgunlaşma programlamasına tabi tutulur 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

Protokol

Fareler, Indiana Üniversitesi Bloomington'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir hayvan protokolüne göre bakılmıştır. Temsili veri üretmek için kullanılan fareler, C57BL6 / J arka planında, dişi ve 8-12 haftalık kontrol (vahşi tip) hayvanlardı. Bu deney için hem erkek hem de dişi fareler kullanılabilir, çünkü farelerin cinsiyetinin deneyin sonucunu etkilemesi pek olası değildir.

1. Lens diseksiyonu ve dekapsülasyonu

1. Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu"na ve kurum tarafından onaylanan hayvan kullanım protokollerine uyarak farelere....

Tartışmalar

Bu protokol, lensin çeşitli derinliklerinden demetlerin veya tekil lens fiber hücrelerinin 3D membran morfolojisini aslına uygun olarak koruyan fiksasyon, koruma ve immün boyama yöntemlerini göstermiştir. Lekeli lens lifleri, lens lifi hücre morfolojisini incelemek için uzun süredir kullanılan SEM preparatları ile karşılaştırılır. Sonuçlar, her iki preparat arasında karşılaştırılabilir membran yapılarını göstermektedir. EM, hücre morfolojisini incelemek için altın standart olmaya devam et.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5