Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.

Özet

Sonsuz kendi kendine çoğalma yeteneğine sahip insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler), nadir hastalık patolojilerinin aydınlatılması, yeni ilaçların geliştirilmesi ve hasarlı organları restore etmeyi amaçlayan rejeneratif tıp dahil olmak üzere çok sayıda alanda uygulamaları olması beklenmektedir. Buna rağmen, hiPSC'lerin sosyal uygulaması hala sınırlıdır. Bu kısmen, iPSC'lerin küçük çevresel değişikliklere karşı yüksek duyarlılığı nedeniyle, ileri bilgi ve sofistike teknik becerilerle bile kültürdeki farklılaşmayı yeniden üretmenin zorluğundan kaynaklanmaktadır. Otomatik bir kültür sisteminin uygulanması bu sorunu çözebilir. Bir araştırmacının becerisinden bağımsız olarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip deneyler, çeşitli enstitüler arasında paylaşılan bir prosedüre göre beklenebilir. Daha önce iPSC kültürlerini koruyabilen ve farklılaşmayı indükleyebilen birkaç otomatik kültür sistemi geliştirilmiş olsa da, bu sistemler insanlaştırılmış, çok eklemli robotik kollardan yararlandıkları için ağır, büyük ve maliyetlidir. Yukarıdaki sorunları iyileştirmek için, daha kompakt, daha hafif ve daha ucuz olmasını sağlayan basit bir x-y-z ekseni kayar ray sistemi kullanarak yeni bir sistem geliştirdik. Ayrıca, kullanıcı yeni taşıma görevleri geliştirmek için yeni sistemdeki parametreleri kolayca değiştirebilir. Bir görev oluşturulduktan sonra, kullanıcının tek yapması gereken iPSC'yi hazırlamak, istenen görev için gereken reaktifleri ve sarf malzemelerini önceden sağlamak, görev numarasını seçmek ve zamanı belirtmektir. Sistemin, besleyici hücreler olmadan birkaç geçiş yoluyla iPSC'leri farklılaşmamış bir durumda tutabildiğini ve kardiyomiyositler, hepatositler, nöral progenitörler ve keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşabildiğini doğruladık. Sistem, yetenekli araştırmacılara ihtiyaç duymadan kurumlar arasında yüksek oranda tekrarlanabilir deneylere olanak tanıyacak ve yeni girişlerin önündeki engelleri azaltarak hiPSC'lerin daha geniş bir araştırma alanı yelpazesinde sosyal olarak uygulanmasını kolaylaştıracaktır.

Giriş

Bu makale, bir firma ile işbirliği yaparak ürettiğimiz insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC) için otomatik bir kültür sistemi için gerçek ve ayrıntılı kullanım prosedürleri sağlamayı ve temsili sonuçları göstermeyi amaçlamaktadır.

Makalenin 2007 yılında yayınlanmasından bu yana, iPSC tüm dünyada dikkat çekmektedir1. En büyük özelliği herhangi bir somatik hücreye farklılaşabilmesi nedeniyle, rejeneratif tıp, inatçı hastalıkların nedenlerinin aydınlatılması ve yeni terapötik ilaçların geliştirilmesi gibi çeşitli alanlarda uygulanması beklenmektedir 2,3....

Protokol

Kansai Tıp Üniversitesi Etik Komitesi, KMUR001 adlı sağlıklı gönüllü kaynaklı iPSC'lerin üretilmesini ve kullanılmasını onayladı (onay No. 2020197). Açıkça işe alınan donör, resmi bilgilendirilmiş onam verdi ve hücrelerin bilimsel kullanımını kabul etti.

NOT: Mevcut arayüz (Windows XP işletim sistemi altında çalışan "ccssHMI" adlı özel yazılım) temel işlem ekranıdır. Yukarıda belirtilen arayüz altında, kullanıcıların çeşitli işlemleri başlatmasına izin veren bir dizi sekme düzenlenmiştir.

1. Yükleme işlemleri

  1. Tıkla Yükleniyor yazılımın üst ekranındaki düğmesine basın. <....

Temsili Sonuçlar

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin bakımı
Üç hPSC hattı (RIKEN-2F, 253G1 ve KMUR001) kullandık. Günlük manuel olarak gerçekleştirilen deneylerle bakım protokolünü optimize ettik ve sistem tarafından gerçekleştirilen yedi ön deney aracılığıyla ayrıntılı programları daha da optimize ettik. Örneğin, insanlar tarafından kullanılan farklı pipetlerden ve sistemden çıkan tükürük akışının sıvı hızlarının neden olduğu kayma gerilmeleri oldukça farklıdı.......

Tartışmalar

Protokoldeki kritik bir adım, bir kullanıcı herhangi bir hata bulursa, herhangi bir zamanda iptal, durdur veya sıfırla düğmesine tıklaması ve ilk adımdan baştan başlamasıdır. Yazılım, çifte rezervasyon, sistem görevleri etkinken kapıların açılması ve ikmal eksikliği dahil olmak üzere insan hatalarından kaçınabilir. İstenilen somatik hücreye başarılı ve verimli bir şekilde farklılaşmak için bir diğer kritik nokta, pluripotent kök hücre hatlarının uygun seçimidir, çünkü her plu.......

Açıklamalar

Yazarın ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japonya'daki Yeni İş Geliştirme Merkezi'nden alınan bir hibe ile desteklenmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% bovine serum albumin fraction VFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm plastic plates Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN Bioresource Research CenterHPS0002
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Actinin  mouseAbcamab9465
Activin A Nacali Tesque18585-81
AdenineThermo Fisher ScientificA14906.30
Albumin  rabbitDakoA0001
All-trans retinoic acidFuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
Automated culture systemPanasonic
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
Bovine serum albuminMerck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFMThermo Fisher Scientific10744019Human keratinocyte medium
DexamethasoneMerck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometerCountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher ScientificC10228
DorsomorphinThermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum Biowest, FL, United StatesS140T
FGF-basic Nacalai Tesque Inc.19155-07
ForskolinThermo Fisher ScientificJ63292.MF
GlutamineThermo Fisher Scientific25030081Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  goatSantacruz6556
HydrocortisoneThermo Fisher ScientificA16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinateMerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021Cell culture matrix
Insulin-transferrin-seleniumThermo Fisher Scientific41400045
Keratin 1  mouseSantacruz376224
Keratin 10  rabbitBioLegend19054
KMUR001Kansai Medical University Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacementThermo Fisher Scientific10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 medium Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin mouseSantacruz23927
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament  rabbitChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1Acell culture medium 
Oct 3/4  mouseBD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
Recombinant human albumin A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN Bioresource Research CenterHPS0014undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
Sodium L-ascorbateMerckA4034-100G
SSEA-4  mouseMilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02cell culture medium 
TnT rabbitAbcamab92546
TRA 1-81 mouseMilliporeMAB4381
TriiodothyronineThermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM express enzyme Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
Trypan blue solution Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
Tryptose phosphate brothMerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-7925 Tublin  mousePromegaG712A

Referanslar

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır