İn Vivo B Hücre Aktivasyonunu İnhibe Ederek ve Galaktoz Eksikliği Olan IgA1 Üretimini In Vitro Azaltarak Diosin Aracılı IgA Nefropatisinin Hafifletilmesi

Özet

Bu çalışma, immünoglobulin A nefropatisinin (IgAN) Dioscoreae Nipponicae Rhizoma'nın (DNR) aktif bileşeni olan Dioscin (DIO) ile tedavisi için deneysel veriler ve bitkisel tıbbın etkilerini ve altta yatan mekanizmaları in vivo ve in vitro olarak incelemek için bir paradigma sunmaktadır.

Özet

Dolaşımdaki galaktoz eksikliği olan IgA1'in (Gd-IgA1) artışı, IgA nefropatisinin (IgAN) patogenezinde kritik bir bağlantı olan mukozal immün yanıtlar sürecinde IgA-pozitif salgı hücrelerinin aşırı aktivasyonundan kaynaklanır. B lenfositlerinin IgA salgılayan plazma hücrelerine dönüştüğü belirgin yer olan Peyer yaması, IgA'nın birincil kaynağıdır. Ek olarak, çekirdek 1β-1,3-galaktosiltransferaz (C1GalT1) ve moleküler şaperonu, C1GalT1'e özgü moleküler şaperonun (Cosmc) daha düşük ekspresyonu, IgAN hastalarında IgA1'in anormal glikosilasyonu ile ilişkilidir. Klinik deneyimlerimiz, Dioscoreae Nipponicae Rhizoma'nın (DNR) bitkisel ilacının IgAN hastalarında proteinüri ve hematüriyi hafifletebileceğini ve böbrek fonksiyonlarını iyileştirebileceğini göstermektedir. Diosin (DIO), çeşitli farmakolojik aktivitelere sahip olan DNR'nin ana aktif bileşenlerinden biridir. Bu çalışma, DIO'nun IgAN tedavisinde olası mekanizmasını araştırıyor.IgAN model fare, mukozal immün indüksiyon ile kurulmuştur. Fareler kontrol, model ve DIO gavaj gruplarına ayrıldı. Farelerde glomerüler IgA birikimi, renal patolojik değişiklikler ve Peyer yamasındaki B hücre belirteçleri CD20 ve CXCR5 ekspresyonu immünofloresan ve immünohistokimya ile tespit edildi. Lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonundan sonra, DIO'nun DAKIKI hücrelerinin proliferasyonu, IgA ve Gd-IgA1 sekresyonu, C1GalT1 ve Cosmc ekspresyonu üzerindeki etkileri, hücre sayma kiti-8 (CCK-8) testi, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) testi, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (QRT-PCR) ve western blotting (WB) ile incelendi. İn vivo çalışmalarda, glomerüler mezanjiyal hiperplazi ile birlikte IgA birikimi ve IgAN model farede Peyer yamasında CD20 ve CXCR5'in artmış ekspresyonu DIO ile hafifletildi. İn vitro çalışmalar, 0.25 μg/mL ila 1.0 μg/mL DIO'nun LPS ile indüklenen DAKIKI hücre proliferasyonunu, IgA ve Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe ettiğini ve C1GalT1 ve Cosmc'nin mRNA ve protein ekspresyonunu yukarı regüle ettiğini gösterdi. Bu çalışma, DIO'nun IgA salgılayan hücrelerin aşırı aktivasyonunu inhibe ederek ve C1GALT1/Cosmc ekspresyonunu yukarı regüle ederek Gd-IgA1 üretimini azaltabileceğini göstermektedir.

Giriş

IgA Nefropatisi (IgAN), spesifik bir tedavisi olmayan en yaygın primer glomerülonefrit türüdür ve son dönem böbrek yetmezliğinin önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir¹. IgAN'ın patogenezi hala tam olarak anlaşılamamış olsa da, "çoklu isabet hipotezi" genel olarak kabul edilmekte ve çok sayıda klinik ve deneysel araştırma kanıtı ile desteklenmektedir². IgAN'ın patogenezi B hücrelerinin aktive edilmesini ve Galaktoz eksikliği olan IgA1 (Gd-IgA1⁾ üretilmesini içerir3. Mukozal immün yanıt sırasında IgA salgılayan hücrelerin aşırı proliferasyonu ve aktivasyonuna bağlı olarak dolaşımdaki Gd-IgA1'deki artış, IgAN ^4,5,6'nın patogenezinde kritik bir bağlantıdır. B lenfosit fenotipinin IgA salgılayan hücrelere dönüşümünün proliferasyonu ve aktivasyonu için merkezi yer olan Peyer yaması, IgAN^7,8'in oluşumu ve gelişimi ile yakından ilişkili olan IgA sekresyonunun birincil kaynağıdır. Ek olarak, IgA1 salgılayan hücrelerin proliferasyonu ve ayrıca Core 1β-1,3-galaktosiltransferaz (C1GalT1) ve C1GalT1'e özgü moleküler şaperon (Cosmc) ekspresyonu, IgA1'in anormal glikozilasyonu ile ilişkilendirildi, bu da IgAN hastalarında GD-IgA1 üretimine neden olur ^6,9.

Bitkisel ilaçlarla IgAN tedavisi ile ilgili klinik çalışmalar son yıllarda ilerlemiştir. Yiqi Qingjie Formülü, Guang'anmen Hastanesi Nefroloji Bölümü tarafından IgAN'ı tedavi etmek için gerekli bir formüldür. Grubumuzun önceki çalışması, Yiqi Qingjie Formülü ile tedaviden sonra IgAN hastalarının serumunda Gd-IgA1'in azaldığını buldu. Yiqi Qingjie Formülünde en çok kullanılan bitkilerden biri olan Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), bağışıklığı düzenlemek, iltihabı baskılamak, öksürüğü ve astımı hafifletmek gibi çeşitli işlevlere sahip olan Dioscorea Nipponica Makino'nun kurutulmuş köksapıdır^10,11. Birkaç bilim adamı IgAN'ı DNR ile tedavi etti ve iyi sonuçlar elde etti 12,13,14. DNR^15'in ana aktif bileşeni olan Dioscin (DIO) ürik asidi düşürür, fibrozu inhibe eder, inflamatuar yanıtı inhibe eder ve antioksidatif stresi inhibe eder^16,17. Bu nedenle, DIO, aşırı Gd-IgA1'in hücresel sekresyonunu inhibe etmek ve spesifik böbrek koruma etkileri uygulamak için yeni bir etki mekanizmasına sahip olabilir. Yine de, DIO'nun IgAN'ı tedavi etmek için etki mekanizması hakkında herhangi bir çalışma bildirilmemiştir.

DIO'nun IgAN üzerindeki potansiyel terapötik mekanizmasını araştırmak ve IgAN tedavisi için yeni bir yöntem sağlamak için, DIO'nun IgAN üzerindeki terapötik etkileri için in vivo ve in vitro deneyler yaptık.

Protokol

Guanganmen Hastanesi etik kurulu bu deneyi onayladı (hayvan deneyi etik onay numarası: IACUC-GAMH-2023-003).

1. Farelerin deneysel prosedür için hazırlanması

1. Hastanenin/araştırma merkezinin hayvan tesisinde 22 SPF dereceli erkek Balb/c faresi (6-7 haftalık, vücut ağırlığı 20-25 g) yetiştirin. Rastgele sayı tablosu yöntemini kullanarak hayvanları kontrol (n = 8) ve model (n = 14) gruplarına bölün.
2. Laboratuvar kafesinde 1 haftalık adaptif yetiştirmeden sonra, model grubunu (IgAN grubu) Zou ve ^ark.18'in modelleme protokolüne göre 9 hafta boyunca 6 mmol/L HCl içeren asitlendirilmiş suda %0.1 sığır gama globulini (BGG) çözeltisi ile besleyin.
3. Bir IgAN deneysel fare modeli¹⁸ hazırlamak için BGG solüsyonu içmeye devam ederken, art arda 3 gün boyunca salin içinde salin içinde 0.1 mL% 0.1 BGG solüsyonu enjekte edin.
4. Kontrol grubunun 9 hafta boyunca BGG olmadan 6 mmol/L HCl asitlendirilmiş suyu serbestçe içmesine izin verin. Karşılık gelen hacimdeki salini art arda 3 gün boyunca kuyruk damarına enjekte edin.
   NOT: Kontrol ve model grupları normal yemle aynı kalitede beslenmiştir.
5. Kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra, kontrol grubunda 2 fare ve model grubunda 2 fareyi rastgele seçin ve modellemenin başarılı olup olmadığını belirlemek için proteinüri, ışık mikroskobu ve immünofloresan ile inceleyin.
   NOT: Hayvanlara yiyecek verilmemektedir, ancak suya maruz kalmaları yasak değildir; idrar çıkışını kaydedin.
6. Metabolik kafeslerle 24 saat boyunca idrar toplayın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin; İdrar tortusunu atın. Süpernatantın 10 kat seyreltilmesinden sonra, bir idrar proteini tahlil kiti kullanarak proteinüri konsantrasyonunu ölçün ve daha sonra 24 saat toplam idrar proteini elde etmek için seyreltme faktörü ve idrar hacmi ile çarpın.
   NOT: Mikroskopi ve immünofloresan yöntemleri sırasıyla bölüm 3 ve 4'te gösterilmiştir.
7. Modeli başarılı bir şekilde hazırladıktan sonra, model grubundaki 12 fareyi, rastgele sayı tablosu yöntemine göre model grubunda (IgAN grubu) ve DIO gavaj grubunda (DIO grubu) olmak üzere 6 fareye bölün.
8. Kontrol grubunun BGG'siz 6 mmol/L HCl asitlenmiş su içmeye devam etmesine izin verin ve model grubu 6 mmol/L HCl içeren asitlenmiş sudan oluşan %0.1'lik BGG solüsyonu. Farmakolojik deneysel metodolojinin doz dönüşüm formülüne göre DIO grubu gavaj uygulamasının dozunu hesaplayın (70 kg'lık insan vücudu kütlesine göre dönüştürülür)¹⁹. Gavaj DIO tabletleri 8 hafta boyunca günde bir kez 0.06 g / kg.
9. 8 haftalık gavajdan sonra, fareleri intraperitoneal olarak% 0.4 pentobarbital sodyum (60 mg / kg) ile uyuşturun ve ayak parmağı tutamıyla uygun anesteziyi onayladıktan sonra, sonraki ışık mikroskobu ve immünohistokimya analizleri için böbrekleri ve Peyer yamasını izole edin.
   NOT: İn vivo model için şema Ek Şekil 1'dedir.

2. Histolojik analiz

1. Böbrekler için parafin bölümleri ve Peyer yaması
   1. 3 mm kalınlığındaki böbrek dokularını veya 1 Peyer yamasını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, gradyan etanol ve ksilen ile kurutun. 2 saat balmumuna batırın, kapatın ve dondurun.
   2. 2 μm kalınlığında böbrek kesitleri ve 4 μm kalınlığında Peyer yama kesitlerini kesin ve ılık suda yayın. Katlanmamış dilimleri temiz bir cam sürgü ile toplayın ve sabit sıcaklıktaki fırında 40 °C'de 1 saat pişirin. Numunenin ön işleminden sonra boyamaya başlayın.
      NOT: Böbreğin hiler kısmının koronal yüzeyini, 3 mm doku bloğu kalınlığında alın.
2. Parafin bölümlerini oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca periyodik asit çözeltisi ile ışıktan arındırın ve boyayın. Damıtılmış su ile durulayın ve Schiff'in boyama solüsyonu ile 20-30 dakika boyunca ışıktan kaçınarak kuru-lekeli olarak silin. Mikroskop altında bölümler kırmızı olana kadar damıtılmış su ile durulayın.
3. Bölümleri hematoksilen boyama solüsyonuna yerleştirin, çekirdekleri 3 dakika boyayın (çok derin boyanmış çekirdekler etanol hidroklorür ile bölünebilir) ve slaytlar renksiz olana kadar akan su ile durulayın.
4. Gradyan konsantrasyonlarında etanol ve ksilen ile rutin dehidrasyon yapın, bölümleri nötr sakızla kapatın ve mikroskop altında gözlemleyin. PAS pozitif kırmızıdır ve çekirdek mavidir.

3. Peyer yamasının immünohistokimyasal analizi

1. Peyer yamasının parafin bölümlerini adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
   NOT: İmmünohistokimyasal ve müteakip immünofloresan için bölümlerin kalınlığı 4 μm'dir.
2. Parafin bölümlerini mumdan arındırın:
   1. Bölümleri 5 dakika ksilen I'e, 5 dakika ksilen II'ye ve 5 dakika ksilen III'e koyun.
   2. Ayrıca, slaytları susuz etanol I'de 5 dakika, susuz etanol II'de 5 dakika, %85 alkolde 5 dakika, %75 alkolde 5 dakika durulayın. Ardından slaytları damıtılmış suyla durulayın.
3. Antijen alımı
   1. 50x stok sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın ve kullanım için damıtılmış su ile 1x'e seyreltin. Otoklavda 2 dakika ısıtın, ardından dilimleri otoklava yerleştirin ve sıvı seviyesinin dilimlerin seviyesini aştığından emin olun.
   2. 5 dakika yüksek sıcaklıkta ısıtın, ardından slaytların doğal olarak soğumasını bekleyin. Dilimleri PBS solüsyonu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
4. Endojen peroksidazın bloke edilmesi: Dokunun sınırlarını immünohistokimyasal bir kalemle bir daire içinde işaretleyin. Bölümleri% 3 hidrojen peroksit çözeltisi içinde% 3 hidrojen peroksit çözeltisi içinde, RT'de 15 dakika inkübe edin, ışıktan koruyun ve bölümleri her seferinde 5 dakika PBS çözeltisi ile üç kez yıkayın.
5. Serum blokajı: RT'de 30 dakika boyunca işaretlenen doku bölümlerine %10 keçi serumu damlatarak bölümleri bloke edin. Bölümlerin leke ile eşit şekilde kaplandığından emin olun.
6. Birincil antikor inkübasyonu: Bloke edici çözeltiyi yavaşça çalkalayın ve hazırlanan birincil antikorun bir kısmını ekleyin (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) bölümüne ekleyin. Kesiti düz bir şekilde ıslak bir kutuya koyun ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: Antikorun buharlaşmasını önlemek için ıslak kutuya az miktarda su ekleyin.
7. İkincil antikor inkübasyonu: Bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca PBS solüsyonu ile üç kez yıkayın. Bölümleri kurulayarak PBS'yi çıkarın, dokuyu birincil antikorun ilgili türlerinin bir damla ikincil antikoru (HRP etiketi) ile örtün ve RT'de 50 dakika inkübe edin.
8. 3,3'-diaminobenzidin (DAB) homojenizasyonu: Bölümleri PBS solüsyonu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Bölümleri kuruladıktan sonra, taze hazırlanmış DAB kromojenik solüsyonunu bölümlerin üzerine bırakın. Mikroskop altında renk gelişim süresini gözlemleyin; Pozitif kahverengimsi sarıdır. Renk gelişimini sonlandırmak için musluk suyuyla durulayın.
9. Boyama çekirdekleri: Hematoksilen ile yaklaşık 1 dakika tekrar boyayın, musluk suyuyla yıkayın ve ardından maviye dönmek için musluk suyuyla 10 dakika durulayın.
10. Dehidrasyon ve sızdırmazlık:
    1. Bölümleri 5 dakika %75 alkole ve 5 dakika %85 alkole yerleştirin. Bölümleri 5 dakika susuz etanol I, 5 dakika susuz etanol II ve 5 dakika susuz etanol III içine yerleştirin.
    2. Bölümleri ksilen I'de 5 dakika yıkayın, hafifçe kuruması için çıkarın ve bölümleri nötr sakızla kapatın.
11. Görüntü elde etme: Mikroskobik inceleme ile Görüntüleri toplayın ve dokunun panoramik görüntü analizi için halo yazılımı ile analiz edin.
    NOT: Hematoksilen lekeli çekirdekler mavidir ve DAB pozitif ekspresyonu kahverengimsi sarı olarak gözlenir.

4. Renal IgA immünofloresan

1. Adım 2.1'de anlatıldığı gibi böbrekler için parafin bölümleri hazırlayın.
2. Dewax parafin bölümleri:
   1. Bölümleri 5 dakika ksilen I'e, 5 dakika ksilen II'ye ve 5 dakika ksilen III'e koyun. Bölümleri susuz etanol I, susuz etanol II, %95 etanol, %90 etanol, %80 etanol, %70 etanol ve %50 etanol içinde her biri 5 dakika işlemden geçirin ve damıtılmış su ile yıkayın.
3. Proteinaz K alımı: Bölümleri kurulayın ve histokimyasal bir kalemle doku bölümünün etrafına bir daire çizin. Dokuyu kaplamak için proteinaz K çalışma solüsyonunu (1: 9 stok solüsyonu ve PBS oranı) damla damla ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bölümleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
4. Hücre zarına nüfuz etmek: Bölümleri hafifçe kurulayın ve ardından üzerlerini %0.1 Triton ile örtün. RT'de 20 dakika inkübe edin ve bölümleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
5. Engelleme: RT'de 30 dakika boyunca bloke etmek için dokuyu eşit şekilde kaplamak için% 10 keçi serumu ekleyin.
6. Birincil antikor inkübasyonu: Dokuyu homojen bir şekilde kaplamak için uygun miktarda keçi anti-fare AF488-konjuge IgA antikoru (1:500) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
7. Boyama çekirdekleri: Dilimleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, 4 ",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyasını bölümlere damla damla ekleyin ve ışıktan koruyarak RT'de 15 dakika inkübe edin.
8. Bölümleri yıkayın ve kapatın: Bölümleri PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından bir antifade montaj ortamı ile kapatın.
9. Mikroskopi ve fotoğrafçılık: Floresan mikroskobu altında kesitleri gözlemleyin ve görüntü alın.
   NOT: DAPI için ultraviyole uyarma dalga boyu 330-380 nm'dir ve emisyon dalga boyu 420 nm, mavi ışıktır. Floresein izotiyosiyanat (FITC) uyarma dalga boyu 465-495 nm'dir ve emisyon dalga boyu 515-555 nm, yeşil ışıktır.

5. Hücre kültürü

1. ATCC, ABD'den insan B lenfosit hattı DAKIKI'yi edinin. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamında kültür DAKIKI hücreleri.
2. Hücreleri 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde kültürleyin ve her 2-3 günde bir alt kültürleyin. Tüm deneyler için logaritmik büyüme aşamasındaki hücreleri kullanın.
3. % 70 -% 80 birleşimde, hücreleri steril bir pipetle toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 140 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, serumsuz ortamla tekrar süspanse edin ve 24 saat sonra, sonraki tedavi için tüm hücreleri hareketsiz bir dönemde bırakın.

6. Normal DAKIKI hücrelerinde güvenli DIO konsantrasyonlarının taranması için LDH sitotoksisite testleri

1. DAKIKI hücrelerini 96 oyuklu plakalarda 4x10⁵ hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın ve bir Düşük kontrol grubu, bir Yüksek kontrol grubu ve farklı DIO konsantrasyonları (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 μg / mL) ayarlayın. Gruplama yöntemine göre ilgili işlemden sonra 24 saat boyunca% 5 CO₂, 37 ° C inkübatörde inkübe edin.
2. Sitotoksisite tespit kitinin talimatlarına göre, yüksek kontrol grubundaki kuyucuk başına 5 μL lizat ekleyin ve ardından plakayı 15 dakika boyunca% 5 CO₂, 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
3. Plakayı çıkarın, her bir oyuğa 100 μL reaksiyon karışımı ekleyin, RT'de 10 dakika karanlıkta inkübe edin ve ardından 50 μL durdurma reaksiyonu çözeltisi ekleyin. Mikroplaka okuyucuda OD değerini 490 nm'de mümkün olan en kısa sürede ölçün.
4. Aşağıdaki formüle göre uygulanan maksimum doz olarak farklı DIO konsantrasyonlarının LDH salım oranını ve %≤10'u hesaplayın: LDH salım oranı = (deneysel kuyu LDH - düşük kontrol LDH) / (yüksek kontrol LDH - düşük kontrol LDH) x %100.

7. DIO'nun DAKIKI hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini tespit etmek için CCK-8 testi

1. Önceki deneylerimizin²⁰ sonuçlarına dayanarak, DAKIKI hücrelerini indüklemek için LPS 40 μg / mL kullanarak bir IgAN modeli oluşturun.
2. Daha sonra, 96 oyuklu plakalarda 4x10⁵ hücre / kuyu tohumlayın ve kontrol, model ve DIO düşük, orta ve yüksek konsantrasyon gruplarına (0.25 μg / mL, 0.5 μg / mL ve 1.0 μg / mL) bölün. Plakaları %5 CO₂, 37 ° C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.
3. Daha sonra, her bir oyuğa 20 μL CCK-8 reaktifi ekleyin ve plakaları 2 saat boyunca inkübatöre (% 5 CO₂, 37 ° C) geri yerleştirin. İnkübasyondan sonra, mikroplaka okuyucuda OD'yi mümkün olan en kısa sürede 450 nm dalga boyunda tespit edin.

8. DIO'nun DAKIKI hücreleri tarafından IgA ve Gd-IgA1 salgılanması üzerindeki etkisini tespit etmek için ELISA

1. DAKIKI hücrelerini 6x10⁶ hücre/kuyucuk yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve hücreleri adım 7.2'ye göre gruplandırın ve tedavi edin. Hücreleri 24 saat kültürleyin, daha sonra süpernatanı elde etmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'da santrifüjleyin.
2. Kit talimatlarına göre IgA ve Gd-IgA1 konsantrasyonlarını tespit edin.

9.qRT-PCR DIO'nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc mRNA seviyeleri üzerindeki etkisini tespit etmek için

1. DAKIKI hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 6x10⁶ hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın, hücreleri adım 7.2'de belirtilen CCK8 gibi gruplandırın ve tedavi edin ve 24 saat inkübe edin. Toplam RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre DAKIKI hücrelerinden toplam RNA'yı çıkarın.
2. Her numune grubundan 1 μL ekstrakte edilmiş RNA aldıktan ve konsantrasyonunu ölçtükten sonra, kit talimatlarına göre her numuneden 1 μg toplam RNA'yı ters olarak cDNA'ya kopyalayın.
3. Ardından, her bir genin ekspresyonunu tespit etmek için RT-PCR amplifikasyonu gerçekleştirin (15 dakika boyunca 95 °C, 10 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C). İç referans olarak ^{β-aktin ile 2-ΔΔCT} yöntemini kullanarak her bir genin ekspresyon seviyesini hesaplayın.
   NOT: Astar dizileri aşağıdaki gibidir:
   C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3';
   Kozmik: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3';
   β-aktin: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.

10. DIO'nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc proteinlerinin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelemek için Western blotlama

1. DAKIKI hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 6x10⁶ hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Bunları adım 7.2'de belirtildiği gibi gruplandırın ve ele alın. 24 saatlik inkübasyondan sonra, her bir hücre grubunu toplayın.
2. Uygun miktarda hücre lizis çözeltisi ekleyin (PMSF: fosfataz inhibitörü: RIPA lizis çözeltisi = 1: 1: 100) ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra 13.500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
3. BCA protein konsantrasyonu test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
4. Protein örneklerini 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile 4: 1'de girdaplama ile karıştırın ve proteini denatüre etmek için karışık örnekleri 100 ° C'de 5 dakika ısıtın.
5. Farklı moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit etmek için, protein işaretleyicisini (5 μL/kuyucuk) ve numuneleri (20 μg/kuyucuk) %12'lik bir SDS-PAGE jelin farklı şeritlerine ekleyin, SDS-PAGE elektroforezini çalıştırın ve jeli PVDF membranlarına aktarın.
6. Membranları RT'de 2 saat boyunca% 5 yağsız sütle bloke edin ve 24 saat boyunca karşılık gelen primer antikorlarla (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) inkübe edin. Dahili kontrol olarak β-aktin antikoru (1:100000) kullanın.
7. Poliviniliden florür (PVDF) membranını 1x Tris-Tamponlu Salin,% 0.1 Tween 20 deterjan (TBST) ile üç kez (10 dakika / saat) yıkayın, ardından karşılık gelen ikincil keçi anti-tavşan IgG antikoru (1: 10000) ile RT'de 2 saat inkübe edin.
8. Membranı tekrar TBST ile yıkayın (her biri 10 dakika boyunca üç kez) ve protein bandı tespiti için uygun miktarda gelişmiş kemilüminesans (ECL) çalışma solüsyonu (üreticinin talimatlarına göre) ile muamele edin.
9. Kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleri yakalayın ve Image J görüntü analiz sistemini kullanarak proteinlerin gri değerlerinin yarı kantitatif bir analizini gerçekleştirin.

11. İstatistiksel analiz

1. Verileri analiz etmek için uygun bir yazılım uygulaması kullanın. Tüm verileri SD (standart sapma) ± ortalama olarak ifade edin ve gruplar arasında karşılaştırma yapmak için tek yönlü bir ANOVA testi ile birden fazla örneği değerlendirin.
   NOT: İstatistiksel analizler için SPSS istatistik programı 26.0 kullanılmıştır. Varyansların eşit olduğu durumlarda gruplar arası iki yönlü karşılaştırmalar için LSD yöntemi, varyansların eşit olmadığı durumlarda gruplar arası iki yönlü karşılaştırmalar için Dunnett T3 yöntemi kullanılmıştır. P<0.05'in istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu düşünüldü.

Tartışmalar

IgAN'ın karakteristik patolojik özelliği, glomerulusun mezanjiyal bölgesinde IgA1 ve GD-IgA1 içeren immün komplekslerin birikmesidir^21,22. İmmün komplekslerin oluşumunu azaltmak, böbrek hasarını azaltabilir ve IgAN'ın klinik semptomlarını hafifletebilir. İn vivo bir deneyde, DIO'nun IgAN üzerindeki terapötik etkilerini inceledik ve DIO'nun IgAN model farelerin böbreğinde IgA birikimini azaltabileceğini bulduk. Böbrekte IgA salgılayan hücrelerin birikiminin IgAN^23'ün patogenezi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. B lenfositlerinin önemli bir proliferasyon ve aktivasyon bölgesi olan Peyer yaması, IgA salgılayan hücrelerin önemli bir kaynağıdır, bu nedenle Peyer'in yamasında B lenfosit belirteçlerinin (CD20, CXCR5) ekspresyonunu inceledik ve DIO'nun Peyer'in IgAN fareleri modelindeki B lenfositlerinin ekspresyonunu inhibe edebileceğini bulduk. Bu deneysel sonuçlar, IgAN tedavisinde DIO'nun uygulanması için bir temel sağlayabilir.

Aşağıdaki deneyleri gerçekleştirdik: DIO'nun IgAN üzerindeki etki mekanizmasını daha fazla araştırmak için in vitro olarak. İlk olarak, bir kısmı GD-IgA1²⁴ olan IgA1 salgılayan EBV ile ölümsüzleştirilmiş bir B hücre hattı olan DAKIKI'nin, ilacın IgAN üzerindeki etki mekanizmasının in vitro araştırması için ideal olduğu daha önce gösterilmiştir. IgAN tedavisinde DIO'nun moleküler mekanizmasını araştırmak için DAKIKI hücrelerini seçtik. Ek olarak, mukozal inflamatuar immün yanıt, IgAN patogenezinde ayrılmaz bir rol oynar. Yukarıda bahsedildiği gibi, pro-inflamatuar faktörleri serbest bırakabilen ve IgAN'daki mukozal immün yanıtların mekanizmasını daha iyi taklit edebilen inflamatuar yanıtlara aracılık edebilen DAKIKI hücrelerini uyarmak için LPS kullanıyoruz. İn vitro hücresel model, IgAN tedavisi için diğer ilaçların olasılığını ve mekanizmasını araştırmaya yardımcı olabilir. Sonuçlar, DIO'nun LPS tarafından konsantrasyona bağlı bir şekilde uyarılan DAKIKI hücrelerinin proliferasyonunu inhibe ettiğini gösterdi. DIO, LPS stimülasyonunun neden olduğu DAKIKI hücrelerinde IgA ve Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe edebilir ve DAKIKI hücrelerinde mRNA ve C1GalT1 proteininin ve şaperonu Cosmoc'un ekspresyonunu yukarı regüle edebilir, bu da DIO'nun C1GALT1/Cosmc ekspresyonunu yukarı regüle ederek Gd-IgA1 salgılanmasını azaltabileceğini ve böylece DAKIKI hücrelerinin aşırı aktivasyonunu inhibe edebileceğini düşündürmektedir.

Deneysel prosedürler sırasında anahtar adımlara dikkat edilmelidir. DAKIKI hücre süpernatantındaki Gd-IgA1 konsantrasyonu, ELISA kitinin (1.56 ~ 100 ng / mL) tespit aralığı içinde değildir ve toplanan süpernatant, konsantre Gd-IgA1'i elde etmek için bir ultrafiltrasyon tüpü ile santrifüjlenmelidir. Ayrıca, her gruptan başlayan süpernatan hacminin aynı olduğundan ve ultrafiltrasyondan sonra elde edilen nihai konsantre hacminin aynı olduğundan emin olun.

Bu çalışmada, farmakolojik etkilerde karşılıklı olarak birbirini destekleyebilen ve bitkisel tıbbın etkilerini ve mekanizmalarını incelemek için örnek teşkil eden hem in vitro hem de in vivo yöntemleri eş zamanlı olarak kullandık. Bu protokolde bazı şeyler geliştirilebilir. İlk olarak, farelerin DIO gavaj grubunda kan konsantrasyonlarını tespit etmedik; bu nedenle, kan konsantrasyonlarına eşdeğer DIO konsantrasyonu in vitro deneylerde kullanılmaz. İkinci olarak, sadece DNR'nin aktif bileşeni olan DIO monomeri araştırıldı; DNR'nin diğer bileşenlerinin IgAN üzerindeki etkileri hala daha fazla çalışmaya ihtiyaç duymaktadır.

Sonuç olarak, bu çalışma IgAN'ın DNR'nin aktif bileşeni olan DIO ile tedavisi için deneysel bir temel oluşturmaktadır. Bu çalışma, IgAN'ın hem in vitro hem de in vivo mukozal immün yanıtını taklit ederek IgAN'ın hücresel patolojik bir modelini oluşturmuştur. IgAN'ı önlemek ve tedavi etmek için geleneksel Çin tıbbını incelemek için yeni bir fikir verir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD20/MS4A1 Antibody	Boster Biotechnology Company	A03780-3
Antifade mounting medium	Beyotime, Shanghai, China	P0128S
Balb/c mice	Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	110322220101424000
blocking serum	Solarbio, Beijing, China	SL038
Bovine gamma globulin	ShangHai YuanYe Biotechnology Company	S12031
C1GALT1 polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc,USA	27569-1-AP
Citrate antigen retrieval solution(50×)	Phygene Biotechnology Company	PH0422
COSMC polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc,USA	19254-1-AP
Cytotoxiciy detection kit	Roche Company	4744926001
Dako REAL EnVision detection system, Peroxidase/DAB+	Dako	K5007
DAPI	Invitrogen	D1306
Dioscin	National Institute For Food and Drug Control	111707-201703
DIO tablets	Chengdu No 1 Pharmaceutical Co. Ltd.	H51023866
ECL working solution	Merck Biotechnology, Inc	WBKLS0100
Enhanced cell counting kit-8	Beyotime, Shanghai, China	C0043
Fasking one-step removal of gene cDNA first-strand synthesis premix	TIANGEN,Beijing, China	KR118-02
Glycogen Periodic acid Schiff (PAS) stain kit	BaSO Biotechnology Company	BA4080A
Goat anti-mouse IgA-AF488	SouthernBiotech	1040-30
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L), HRP conjugated	BeiJing Bioss Biotechnology Company	BS-0295G-HRP
Human Gd-IgA1 ELISA kit	IBL	27600
Human IgA ELISA kit	MultiSciences (LiankeBio)	70-EK174-96
Pierce BCA protein assay kit	Thermo Scientific	23227
PMSF solution	Beyotime, Shanghai, China	ST507
Proteinase K	Phygene Biotechnology Company	PH1521
Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody	BeiJing Bioss Biotechnology Company	bs-23570R
RIPA lysis buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013B
RNAsimple total RNA extraction kit	TIANGEN,Beijing, China	DP419
RPMI Medium 1640	Solarbio, Beijing, China	31800
Super-Bradford protein assay kit	CWBIO, Beijing, China	CW0013
Triton X-100	Beyotime, Shanghai, China	ST795
β-Actin Rabbit mAb	Abclonal, Wuhan, China	AC026