İnsan Eksfoliye Edilmiş Yaprak Döken Dişlerden İmmünfenotipli Mezenkimal Kök Hücrelerin Tek Hücreli Sınıflandırılması

Özet

Bu protokol, tek hücreli sıralama yöntemi kullanılarak insan mezenkimal kök hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanımını açıklar. Spesifik olarak, tek hücreli ayıklamanın kullanımı, multiparametrik akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, heterojen bir popülasyondan immünofenotiplenmiş hücrelerin %99 saflığını sağlayabilir.

Özet

Bir organizmanın mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler), vücuttaki birden fazla yetişkin hücre soyuna farklılaşmak için olağanüstü bir kapasiteye sahiptir ve immünomodülatör ve antienflamatuar özellikleri ile bilinir. Bu kök hücrelerin kullanımı, rejeneratif biyoloji alanı için bir nimettir, ancak aynı zamanda, bunlarla ilişkili çoklu hücresel belirsizlikler nedeniyle rejeneratif tıp ve terapötikler için bir felakettir. Bu belirsizlikler, bu kök hücrelerin kaynağındaki çeşitlilikten ve her ikisi de fonksiyonel heterojenliklerini yansıtan in vitro büyüme koşullarından kaynaklanabilir.

Bu, terapötik uygulamalar için saflaştırılmış, homojen MSC popülasyonları sağlamak için metodolojileri garanti eder. Akış sitometrisi alanındaki gelişmeler, multiparametrik bir yaklaşım kullanılarak tek hücreli popülasyonların saptanmasını sağlamıştır. Bu protokol, floresan destekli tek hücreli sıralama yoluyla insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED'ler) kök hücreleri tanımlamanın ve saflaştırmanın bir yolunu ana hatlarıyla belirtir. CD90-floresein izotiyosiyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofil proteini (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikosiyanin (APC) ve CD44-V450 gibi yüzey belirteçlerinin eşzamanlı ekspresyonu, multiparametrik akış sitometrisi kullanarak MSC'lerin "parlak", pozitif ekspresörlerini tanımladı. Bununla birlikte, bu pozitif belirteçlerin dörtlü ekspresyonörlerinin yüzdelerinde 7. pasajdan sonraki pasajlara kadar önemli bir düşüş gözlendi.

İmmünfenotipli alt popülasyonlar, sadece iki pozitif ve bir negatif markörün dahil etme kriterlerini oluşturduğu tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandı. Bu metodoloji, tasnif edilen popülasyonların hücre canlılığını sağladı ve tasnif sonrası hücre proliferasyonunu sürdürdü. Bu tür bir sıralama için aşağı akış uygulaması, kapılı alt popülasyonlar için soya özgü farklılaşmayı değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izolasyon koşullarını iyileştirmek ve çoklu hücre yüzeyi işaretleyici bilgisi elde etmek için diğer tek hücreli sistemlere uygulanabilir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), hücre bazlı tedaviler için uygun, ölçeklenebilir bir hücre kaynağı olarak kabul edilebilir ve rejeneratif tıpta altın standart bir sistem olarak kabul edilebilir. Bu hücreler, vücutta farklı doku kökenlerine sahip çeşitli kaynaklardan izole edilebilir¹. Kaynak dokularına bağlı olarak, her MSC tipi belirsiz bir in vitro davranış sergiler². Bu, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinde iyi gözlenir³. Çok sayıda çalışma, yetişkin doku farklılaşması, genomik durum ve MSC'lerin metabolik ve hücresel mimarisi dahil olmak üzere boyutlarda klonal varyasyon göster....

Protokol

Etik onay ve katılım onayı: İnsan pul pul dökülmüş diş pulpası örnekleri, Sri Rajiv Gandhi Diş Hekimliği Koleji ve Hastanesi (SRGCDS) Ağız ve Maksillofasiyal Departmanı, Bengaluru tarafından bilgilendirilmiş onam ve tam etik onay alındıktan sonra, Hastane Etik Onay Komitesi tarafından belirlenen standartlara uygun olarak alındı. Bunu takiben, SHED'lerin izolasyonu, kültürü, bakımı ve uygulanması, MAHE - Bengaluru'daki Manipal Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ndeki Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR) tarafından önerilen kılavuzlara uygun olarak onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna

Tartışmalar

Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında, doğum sonrası kaynaklar arasında, oral doku kaynaklı MSC'ler, asgari etik yükümlülükleri ve dikkate değer çok soylu farklılaşma potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi çekmiştir²¹. Gömülü üçüncü azı dişinden ve SHED'lerden elde edilen diş pulpası kök hücreleri (DPSC'ler), nörodejeneratif ve travmatik hastalıklardaki terapötik potansiyelleri nedeniyle dental MSC'ler arasında en fazla ilgiyi görmüştür

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5