Rekombinant RCAS(A) Retrovirüsünün Embriyonik Tavuk Lensine Mikroenjeksiyonu

Özet

Bu protokol belgesi, lens gelişimi sırasında in situ fonksiyon ve proteinlerin ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak bir RCAS(A) retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini açıklamaktadır.

Özet

Embriyonik tavuk (Gallus domesticus), insan merceği ile yüksek derecede benzerliği göz önüne alındığında, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir. RCAS(A), erken gelişim aşamalarında lens vezikülünün boş lümenine mikroenjeksiyon yoluyla lens gelişimi sırasında vahşi tip ve mutant proteinlerin in situ ekspresyonunu ve işlevini incelemek için güçlü bir araç görevi gören, bölünen hücreleri enfekte eden, replikasyona yetkin bir tavuk retrovirüsüdür. Transgenik modeller ve ex vivo kültürler gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanılması, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sağlar. Spesifik olarak, hedeflenen gen transferi, dokuya özgü promotörlere ihtiyaç duymadan proliferatif lens lifi hücreleriyle sınırlandırılabilir. Bu yazıda, rekombinant retrovirüs RCAS(A) hazırlığı için gereken adımları kısaca gözden geçireceğiz, mikroenjeksiyon prosedürüne ayrıntılı, kapsamlı bir genel bakış sunacağız ve tekniğin örnek sonuçlarını sunacağız.

Giriş

Bu protokolün amacı, bir RCAS(A)'nın (replikasyona yetkin kuş sarkomu/lökoz retrovirüsü A) embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini tanımlamaktır. Embriyonik bir tavuk merceğinde etkili retroviral uygulamanın, normal mercek fizyolojisi, patolojik koşullar ve gelişiminde mercek proteinlerinin moleküler mekanizması ve yapı-işlevinin in vivo çalışması için umut verici bir araç olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu deneysel model, terapötik hedeflerin tanımlanması ve insan konjenital kataraktları gibi durumlar için ilaç taraması için kullanılabilir. Toplamda, bu protokol, lens proteinlerinin incelenmesi için özelleştirilebilir bir platformun geliştir....

Protokol

Bu çalışma, Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliği'nin Uygulama Yönetmeliği'ne uygun olarak, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Protokole genel bir bakış için bkz. Şekil 1; Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

Tartışmalar

Bu deneysel model, bozulmamış mercekte ilgilenilen protein(ler)i ifade etme fırsatı sunar ve bu proteinlerin mercek yapısı ve işlevindeki işlevsel öneminin incelenmesine yol açar. Embriyonik civciv mikroenjeksiyon modeli kısmen Fekete et. ^al.6 ve Jiang et tarafından daha da geliştirildi. ^al.8 ve hem viral plazmitleri hem de agonistler, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ve peptitler gibi ajanları^{civcivlerin merceğine} 1,9,10,11,12,1.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette