İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Özet

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

Özet

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılan yetişkin pluripotent kök hücrelerdir. Somatik doku kaynaklı MSC'ler sınırlı bağış, kalite varyasyonları ve biyogüvenlik ile kısıtlandığından, son 10 yılda insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) MSC'ler üretme çabalarında büyük bir artış görülmüştür. hiPSC'lerin MSC'lere farklılaşmasına yönelik geçmiş ve son çabalar iki kültür metodolojisi etrafında toplanmıştır: (1) embriyoid cisimciklerin (EB'ler) oluşumu ve (2) tek katmanlı kültürün kullanımı. Bu protokol, hiPSC'lerden MSC türetilmesinde bu iki temsili yöntemi açıklar. Her yöntem, zaman, maliyet, hücre proliferasyon yeteneği, MSC belirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma yetenekleri dahil olmak üzere avantaj ve dezavantajlarını sunar. Bu protokol, her iki yöntemin de hiPSC'lerden olgun ve işlevsel MSC'ler türetebileceğini göstermektedir. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterize edilirken, EB yöntemi daha düşük zaman tüketimi ile karakterize edilir.

Giriş

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) mezoderm kaynaklı yetişkin pluripotent kök hücrelerdir¹. MSC'ler hemen hemen tüm bağ dokularında bulunur². MSC'ler ilk olarak 1970'lerde keşfedildiğinden ve 1987'de Friedenstein ve ark.3,4,5 tarafından kemik iliğinden başarılı bir şekilde izole edildiğinden beri, kemik, kıkırdak, tendon, kas, yağ dokusu ve hematopoietik destekleyici stroma gibi MSC'leri izole etmek için çeşitli insan somatik (fetal ve yetişkin dahil) dokular kullanılmıştır

Protokol

1. hiPSC'lerin bakımı

1. HiPSC'nin çözülmesi
   1. Hücreleri sıvı nitrojenden çıkarın ve hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Çözdürme hücrelerini 3 mL iPSC bakım ortamı ile hazırlanmış 15 mL'lik bir tüpe aktarın (Malzeme Tablosu). Ortamı yavaşça karıştırın.
   2. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 μM Y-27632 ile 1 mL iPSC bakım ortamında nazikçe yeniden süspanse edin (hücreleri 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin).
   3. Hücre süspansiyonunu, büyüme faktörü azaltılmış (GFR) -hücre dışı matris jeli (1:100) ve önceden 10 μM Y-27632 eklenmiş (yaklaşık ....

Tartışmalar

Bu protokolde, hiPSC'leri MSC'lere ayırmanın iki temsili yöntemi incelenmiştir 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Her iki yöntem de MSC'leri hiPSC'lerden türetme yeteneğine sahipti. Hi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100