Dehücreli Akciğer Ekstraselüler Matriks Hidrojellerinin Geliştirilmesi ve Karakterizasyonu

Özet

Protokol, doğal sığır pulmoner dokularına uygulanan iki farklı hücre dışı bırakma metodolojisini açıklığa kavuşturur ve bunların ilgili karakterizasyonlarının kapsamlı bir açıklamasını sağlar.

Özet

Hücre dışı matriks (ECM) türevi hidrojellerin doku mühendisliğinde kullanımı, hücrelerin doğal ortamını in vitro olarak taklit edebildikleri için giderek daha popüler hale gelmiştir. Bununla birlikte, ECM'nin doğal biyokimyasal içeriğini korumak, mekanik stabiliteyi sağlamak ve hücreden arındırma işleminin ECM hidrojellerinin mekanik özellikleri üzerindeki etkisini anlamak zordur. Burada, iki farklı protokol kullanılarak sığır akciğer dokusunun hücreden arındırılması için bir boru hattı, hücreden arındırmanın etkinliğinin aşağı akış karakterizasyonu, sulandırılmış hücreden arındırılmış akciğer ECM hidrojellerinin üretimi ve mekanik ve sitouyumluluk özelliklerinin değerlendirilmesi anlatılmıştır. Sığır akciğerinin hücreden arındırılması, fiziksel (donma-çözülme döngüleri) veya kimyasal (deterjan bazlı) bir yöntem kullanılarak gerçekleştirildi. Hematoksilen ve Eozin boyama, ana ECM bileşenlerinin hücreden arındırılmasını ve tutulmasını doğrulamak için yapıldı. Decellularize örneklerde rezidüel kollajen ve sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) içeriğinin değerlendirilmesi için sırasıyla Sirius kırmızısı ve Alcian mavisi boyama teknikleri kullanıldı. Hücrelerden arındırılmış akciğer ECM hidrojellerinin mekanik özellikleri, salınımlı reoloji ile karakterize edildi. Sonuçlar, hücrelerden arındırılmış sığır akciğer hidrojellerinin, çoğu doğal ECM bileşenini koruyarak ticari ECM ürünlerine güvenilir bir organotipik alternatif sağlayabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu bulgular, tercih edilen hücre çözme yönteminin, jelleşme kinetiğinin yanı sıra elde edilen hidrojellerin sertlik ve viskoelastik özelliklerini önemli ölçüde etkilediğini ortaya koymaktadır.

Giriş

Konvansiyonel tek tabakalı kültür koşulları, doğal doku mikro ortamlarının sadık bir temsilini sunmaz ve hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimlerini sağlayan öğretici ligandlarla üç boyutlu (3D) bir iskele sağlama yeteneğinden yoksundur¹. Ekstraselüler matriks (ECM) bileşimi ve mekanik özellikleri oldukça dokuya özgüdür, zamana bağlıdır ve patolojik durumlarda değişikliklere uğrar. Bu nedenle, bu özelliklerin ayarlanabilirliğine, hücresel davranışın modülasyonuna ve istenen doku işlevselliğinin elde edilmesine izin veren biyomimetik 3D doku modellerine ihtiyaç vardır. Doğal ECM'den türetilen biyomalzemeler, dokuya özgü ECM ^1,2,3,4,5'i doğrudan kullanabilme yeteneği ile doku mühendisliğinde büyük ilgi görmektedir. ECM tabanlı taşıyıcılar, doku rejenerasyonundan hastalık modeli geliştirmeye kadar birçok uygulamada kullanılmıştır. Enjekte edilebilir veya implante edilebilir biyomateryal iskeleleri ^4,5, ilaç tarama uygulamalarında ^6,7, hücre büyümesini indükleyen materyallerin geliştirilmesinde ^8,9,10, biyo-mürekkepler 11,12,13, mikroakışkanlar¹⁴ ve kanser dokusu modellerinde 15,16,17^,18,19.

Doku ve organların hücreden arındırılması, dokuya özgü ECM'yi taklit eden yapı iskeleleri oluşturmak için popüler bir yaklaşımdır. Hücrelerden arındırılmış doku ve organların hidrojeller halinde sulandırılması, hücrelerin biyomimetik 3D doku modellerine gömülmesine izin verir²⁰. Hücre çözme teknikleri, esas olarak ECM bileşimini korurken hücresel bileşenleri ortadan kaldırmaya odaklanır. Dokuları hücreden arındırmak için donma-çözülme döngüleri gibi fiziksel yöntemler veya Triton-X-100 tedavisi gibi kimyasal işlemler yaygın olarak uygulanır. Ayrıca, hücre gömülmesi üzerine immünolojik yanıtları en aza indirmek için kalıntı DNA'nın uzaklaştırılması için DNaz tedavisi tercih edilir. Hücre giderme prosedürlerini optimize etmek için maksimum hücre giderimi ve minimum ECM bozulması elde etmek çok önemlidir²¹. Bu yönlerin yanı sıra, yeniden yapılandırılmış iskelelerin viskoelastisite ve sertlik dahil olmak üzere biyokimyasal ve mekanik özelliklerinin karakterizasyonu, doğal matrislerden türetilen tasarlanmış 3D doku modellerinin iyileştirilmesi için çok önemlidir²⁰.

Akciğer doku mühendisliğinde organa özgü ECM, gelişimsel, homeostatik veya patolojik süreçleri in vitro modellemek ve terapötikleri fizyo-mimetik bir ortamda test etmek için pulmoner mikroçevrenin taklit edilmesine izin verir 20,22,23. Önceki çalışmalar, sıçanlar, domuz eti ve insanlar gibi çeşitli türlerden akciğer dokusunun hücreden arındırıldığını göstermiştir, ancak bu yöntemler henüz sığır gibi daha az kullanılan türlere uyarlanmamıştır. Hücreden arındırma sürecinin parametrelerinin ve bunların biyokimyasal bileşim ve mekanik özelliklerle ilgili olarak ortaya çıkan yeniden yapılandırılmış ECM iskelelerini nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılması, bu yönlerin daha iyi ayarlanmasına izin verecek ve sağlık ve hastalıkta daha güvenilir doku modellerinin önünü açacaktır. Bu çalışmada, donma-çözülme siklusları ve Triton-X-100 tedavisi olmak üzere iki farklı yöntemle sığır akciğeri hücreden arındırma açıkça tanımlanmış ve ardından hücrelerden arındırılmış akciğer ECM (dECM) hidrojellerinin biyokimyasal ve mekanik analizleri yapılmıştır. Bulgular, her iki yöntemin de ECM ligandlarının etkili bir şekilde hücreden arındırılmasını ve tutulmasını sağladığını ortaya koymaktadır. Özellikle, yöntem seçimi, sulandırılmış hidrojellerin ortaya çıkan sertliğini ve viskoelastisitesini önemli ölçüde değiştirir. Sığır dECM'sinden türetilen hidrojeller, insan akciğerinin hücre dışı matrisi ile dikkate değer biyokimyasal analojiler gösterir ve güvenilir termal jelleşme özellikleri sergilerler²⁰. Daha önce açıklandığı gibi, her iki yöntem de akciğer kanseri hücrelerinin, sağlıklı bronşiyal epitel hücrelerinin ve hasta kaynaklı akciğer organoidlerinin 3D kültürü için uygundur²⁰.

Protokol

Genç (1-2 yaş) sığır donörlerinden taze yerli akciğerler, yerel bir mezbahadan elde edildi ve buz üzerinde kapalı bir plastik kapta laboratuvara taşındı. Hayvan kurbanı, genel et tüketimi (atık olarak atılan akciğerler) için yapılır ve çalışma ile ilgili veya çalışma nedeniyle değildir. Kesimhanenin ulusal hayvan kurban etme yasalarına ve yönetmeliklerine uygun olduğunu onaylıyoruz. Ayrıca, sadece atık malzeme kullandığımızı ve araştırma projesinin kurban edilen hayvan sayısı üzerinde bir etkisi olmadığını teyit ediyoruz.

1. Organların toplanması ve doku hazırlığı

1. Deneye kadar taze elde edilen sığır akciğer dokularını -80 °C'de saklayın.
2. Deney günü, donmuş akciğer dokularının oda sıcaklığında çözülmesini bekleyin.
3. Trakea ve kıkırdaklı hava yollarını çıkarmak için dokuları steril neşter ve makasla inceleyin ve küçük parçalara ayırın (5 mm³).
4. En az 3x %2 penisilin / streptomisin (P / S) içeren ultra saf su ile iyice yıkayın.

2. Dokuların hücresizleştirilmesi

NOT: Doğal sığır akciğer dokuları iki farklı protokol kullanılarak hücreden arındırılmıştır.

1. Donma-çözülme yöntemi
   1. Doku örneklerini 1. adıma göre hazırlayın. Kıyılmış dokuları steril damıtılmış suda (_dH2O) 1 dakika boyunca% 2 iyot çözeltisine daldırın. Steril dH₂O'da art arda iki yıkama gerçekleştirin.
   2. Kıyılmış doku parçalarını 15 mL seviyesine kadar 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve taşınabilir bir sıvı nitrojen kabı kullanarak beş manuel donma-çözülme döngüsü uygulayın. Tüpleri steril dH₂O ile doldurun ve tüpleri sıvı nitrojen içinde 2 dakika dondurun. 2 dakika sonra hemen 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın. Bu, 1 döngü donma-çözülme oluşturur.
   3. Numuneleri 10 mL DNaz çözeltisi (10 U/mL) ile 10 mM MgCl₂ tamponunda (pH 7.5) 100 rpm'de sabit çalkalama altında 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   4. Her 24 saatte bir çözelti ikmali ile 100 rpm'de sürekli çalkalayarak 3 gün boyunca steril dH₂O ile kapsamlı bir yıkamaya devam edin.
   5. Liyofilizasyon ve kriyofrezelemeyi aşağıdaki gibi gerçekleştirin²⁰: Islak dECM numunelerini -80 °C'de 24 saat dondurun. Dondurulmuş numuneleri bir liyofilizatöre aktarın ve tamamen kuruyana kadar 3 ila 4 gün vakum altında kurutma modunda çalıştırın. Dondurarak kurutmanın tamamlanmasının ardından, bir öğütme aparatı ve kuru buz kullanarak numunelerin ince bir toz formuna öğütülmesini gerçekleştirin.
      NOT: Bu ince toz hali, sindirim işleminin sonraki aşamalarında gelişmiş çözünürlük özellikleri nedeniyle gerekli kabul edilir.
2. Triton-X-100 yöntemi
   1. Doku örneklerini 1. adıma göre hazırlayın. Akciğer dokularını 4 ° C'de hafif rotasyon altında 3 gün boyunca% 1 Triton-X-100 ile tedavi edin. Her 24 saatte bir değişim çözümü.
   2. Numuneleri DNaz çözeltisi (10U/mL) ile 10 mM MgCl₂ tamponunda (pH 7.5) 37 °C'de 1 saat sabit çalkalama altında inkübe edin.
   3. Her 24 saatte bir çözelti ikmali ile yumuşak rotasyon altında 3 gün boyunca steril dH₂O ile kapsamlı bir yıkamaya devam edin.
   4. Liyofilizasyonu ve ardından adım 2.1'de açıklandığı gibi kriyo-frezelemeyi gerçekleştirin.

3. Pepsin sindirimi

1. Toz haline getirilmiş dECM örneklerini pepsin çözeltisi içinde 15 mg/mL (a/h) konsantrasyonda sindirin (0.01 M HCl, pH 2 içinde 1 mg/mL pepsin). Etkili parçalama için numune parçalama işlemini oda sıcaklığında 48 saat boyunca sürekli karıştırarak gerçekleştirin ve çözeltinin pH'ını sık sık koruyun.
2. Digestleri bir tüpe aktarın ve 5000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı toplayın ve 5M NaOH ve 10x PBS ilavesiyle fizyolojik koşullara (pH 7, 1x fosfat tampon salin (PBS)) nötralize edin ve tamponlayın.
   NOT: Asidik sindirimin pH ayarlaması için konsantre alkali çözeltilerin kullanılması önerilir, çünkü bu yaklaşım, sonraki adımlarda jelleşmeyi zararlı bir şekilde etkileyebilecek istenmeyen hacim genişlemesini önler.
4. Daha ileri çalışmalar için ön jel sindirimlerini −20 °C'de saklayın.

4. Histolojik boyama

1. Gece boyunca 4 ° C'de 1 mL %3.7 formaldehit çözeltisi içinde hücreden arındırılmış doku örneğinin küçük bir kısmını (5 mm³) sabitleyin.
2. PBS'de 1 ml% 30 sükroz çözeltisi içeren tüplerdeki dokuları sabit bir kaya üzerinde 4 ° C'de 12 saat inkübe edin.
3. Dokuları optimum kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömmek için, bir kriyokalıba 1 mL OCT dökün, dokuyu kriyokalıbın ortasına yerleştirin, ardından dokunun üzerine 2 mL OCT dökün.
4. Doku içeren kriyokalıpları kuru buz üzerine yerleştirin ve sıvı nitrojen kullanarak dondurun. OCT tamamen beyaza döndüğünde numuneler hazırdır, bu genellikle 3 dakika sürer. OCT gömülü dokuları kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
5. Poli-L-lizin kaplı bir cam slayt üzerinde -25 ° C'de kriyostatta 10 μm'lik kesitler elde edin ve doku bölümünün slayt üzerinde erimesini sağlamak için slaytı oda sıcaklığına aktarın. Slaytları kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
6. Hücreden arındırmadan sonra çekirdeğin yokluğunu doğrulamak için, aşağıda açıklandığı gibi bir Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyaması gerçekleştirin.
   1. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytları PBS'ye daldırın ve kullanıma hazır 50 mL hematoksilen çözeltisi ile bir boyama kavanozunda 3 dakika boyayın, ardından 3 dakika musluk suyuyla yıkayın.
   2. Slaytları %95 etanole batırın ve 50 mL %0.5 alkollü Eosin çözeltisi ile bir boyama kavanozunda 45 saniye boyayın.
7. Hücreden arındırma işleminden sonra kollajen içeriğinin korunduğunu göstermek için Sirius kırmızı boyama yapın.
   1. Slaytları PBS ile nemlendirin ve 1 saat boyunca bir boyama kavanozunda doymuş sulu pikrik asit çözeltisinde 50 mL% 0.1 Sirius kırmızısına daldırın.
   2. Slaytları %0,5 asetik asit solüsyonunda 5 saniye durulayın ve tüm slaytları sırayla %70, %95 ve %100 etanole her biri 1 dakika bekleterek kurutun.
8. Doku örneklerindeki sGAG içeriğini analiz etmek için, aşağıda açıklandığı gibi Alcian mavisi boyama yapın.
   1. Slaytları 50 mL %1 Alcian mavisi içinde %3 asetik asit çözeltisine (pH 2.5) 30 dakika boyama kavanozuna daldırın. Slaytları akan musluk suyuyla 2 dakika yıkayın.
   2. Tüm slaytları sırayla %70, %95 ve %100 etanole 1 dakika batırarak kurutun.
9. Numunelerin üzerine 0,1 mL montaj ortamı ekleyin ve 10x büyütme kullanarak ışık mikroskobu kullanarak görselleştirin.

5. Mekanik karakterizasyon

1. Paralel plaka geometrisine sahip bir reometre kullanarak salınımlı reoloji ölçümleri uygulayın.
2. Hızlı jelleşmeyi önlemek için buz üzerinde tutulan 250 μL ön jel solüsyonunu önceden soğutulmuş (4 °C) bir alt plakaya dökün.
3. Ön jel çözeltisi iki plaka arasında 1 mm boşluk genişliğine sahip bir disk oluşturana kadar 20 mm paralel plakayı indirin.
4. Ölçümü hemen başlatın. Jelleşme kinetiğini gözlemlemek için alt plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtırken sabit bir frekans ve gerinim ile zaman içindeki depolama ve kayıp modüllerini ölçün. 0,5 Hz sabit frekans ve %0,1 gerinim kullanın.
5. Depolama modülü değerinin artması durduktan ve bir platoya ulaştıktan sonra bir sürünme-kurtarma testi gerçekleştirin.
6. Hidrojele 15 dakika boyunca 1 Pa kesme gerilimi uygulayın, gerilimi ölçün, numuneyi gerilimden boşaltın ve gerinim değerindeki değişikliği 15 dakika boyunca kaydedin.
7. Stresi gevşetme davranışını göstermek için bir gerilme-zaman grafiği çizin. Üç farklı dECM özeti için ölçümleri kopya olarak tekrarlayın.

Sonuçlar

Hücresizleştirme
Doğal akciğer mikroçevresini özetleyecek dECM hidrojelleri üretmek için sığır akciğer dokusunun hücreden arındırılması, hem fiziksel (donma-çözülme) hem de kimyasal (Triton-X-100) yöntemlerle sağlanmıştır. Diseksiyondan sonra, doku parçaları, daha sonra dECM hidrojellerinin sterilitesini etkileyebilecek patojenleri uzaklaştırmak için_dH2Oiçeren antibiyotiklerde yıkandı. Hücresel yapıları bozmak için donma-çözülme yöntemi için sıvı ...

Tartışmalar

Organ kaynaklı hidrojeller, doğal doku ECM'sini özetleyen ve organotipik hücresel fonksiyonu taklit eden umut verici modeller haline gelmiştir. Hücre dışı akciğer ECM'si doku mühendisliğinde sıklıkla kullanılmış olsa da, biyomateryal bileşiminin ve mekanik özelliklerin kapsamlı bir karakterizasyonu, homeostaz veya hastalık sırasında biyolojik süreçleri modellemek için hücre-ECM etkileşimlerinin nasıl modüle edilebileceğinin daha iyi anlaşılmasına fayda sağlayacaktır. Özellikle, suland...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298