Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Özet

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Özet

Yararlı ve probiyotik bakteriler, konakçılarında önemli roller oynar ve bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklık da dahil olmak üzere çeşitli sağlık yararları sağlar. Lactobacillaceae ailesi, doğrulanmış probiyotik özelliklere sahip Gram pozitif bakterilerden oluşur. Bu çalışma, hücresel agregasyonun incelenmesinde tek hücreli yüksek verim analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillaceae türlerini bir model olarak kullanmaktadır. Odak noktası, bu faydalı türlerin diyetteki basit karbonhidratlara tepkisini analiz etmektir.

Çalışma, Görüntüleme Akış Sitometrisinin (IFC), karbonhidratların varlığında ve yokluğunda probiyotik bakterilerin montajındaki temel farklılıkların üstesinden nasıl gelebileceğini göstermektedir. IFC, konvansiyonel akış sitometrisinin gücünü ve hızını mikroskopinin uzamsal çözünürlüğü ile birleştirerek, faydalı bakteri suşları ve koşullarından oluşan bir kütüphane boyunca fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümler sağlar. Bu protokol, Lactobacillaceae türlerinin otoagregasyonu hakkında bilgi sağlar ve diyet karbonhidratlarına verdikleri tepkilere ışık tutarak, bu probiyotik bakterilerin yararlı etkilerinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunur.

Giriş

Bakteriyel otoagregasyon, biyofilm oluşumunda birincil adım olarak kabul edilir. Bu süreçte (bazen otoaglütinasyon veya flokülasyon olarak da adlandırılır), aynı tipteki bakteriler, sonunda kültür tüplerinin dibine yerleşen veya hedef dokularına veya yüzeylerine^yapışan çok hücreli kümeler oluşturur 1.

Otoagregasyon yaygın olarak gözlenen bir fenomendir ve şimdiye kadar fırsatçı patojen Acinetobacter baumannii², diş patojeni Aggregobacter actinomycetemcomitans³ ve ortaya çıkan patojen Burkholderia pseudomallei⁴ gibi Gram....

Protokol

Örnek olarak Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) şablonunu içeren .ast dosyası, Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır.

1. Medya hazırlığı

1. Üreticinin talimatlarına göre Lactobacilli MRS suyunu (1 L deiyonize suda 55 g) ve %1.5 (a/h) agar içeren Lactobacilli MRS agar plakalarını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Otoklav sterilizasyonundan sonra, ortam doğrudan kullanıma hazırdır veya 4 °C'de saklanabilir.
2. % 50 (1 L deiyonize suda 15 g) Triptik soya suyu (TSB) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız), TSB %1 (a/h) D- (+) - glikoz ve% 1 (a / h) D- (+....

Tartışmalar

Akış sitometrisi, ökaryotik hücrelerde floresan yoğunluklarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak daha büyük boyutları veya küçük agregaları nedeniyle bakteri hücreleri için doğru ölçümler sağlayamayabilir. Bu faktörler, farklı koşullarda otoagregasyonun kesin miktar tayinini ve bazal agrega oluşumu seviyesini önemli ölçüde etkileyebilir. Bunu ele almak için, karbonhidratların probiyotik bakterilerin agregasyonunu nasıl etkilediğine dair daha iyi bir çözün?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G