Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Özet

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Özet

Yararlı ve probiyotik bakteriler, konakçılarında önemli roller oynar ve bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklık da dahil olmak üzere çeşitli sağlık yararları sağlar. Lactobacillaceae ailesi, doğrulanmış probiyotik özelliklere sahip Gram pozitif bakterilerden oluşur. Bu çalışma, hücresel agregasyonun incelenmesinde tek hücreli yüksek verim analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillaceae türlerini bir model olarak kullanmaktadır. Odak noktası, bu faydalı türlerin diyetteki basit karbonhidratlara tepkisini analiz etmektir.

Çalışma, Görüntüleme Akış Sitometrisinin (IFC), karbonhidratların varlığında ve yokluğunda probiyotik bakterilerin montajındaki temel farklılıkların üstesinden nasıl gelebileceğini göstermektedir. IFC, konvansiyonel akış sitometrisinin gücünü ve hızını mikroskopinin uzamsal çözünürlüğü ile birleştirerek, faydalı bakteri suşları ve koşullarından oluşan bir kütüphane boyunca fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümler sağlar. Bu protokol, Lactobacillaceae türlerinin otoagregasyonu hakkında bilgi sağlar ve diyet karbonhidratlarına verdikleri tepkilere ışık tutarak, bu probiyotik bakterilerin yararlı etkilerinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunur.

Giriş

Bakteriyel otoagregasyon, biyofilm oluşumunda birincil adım olarak kabul edilir. Bu süreçte (bazen otoaglütinasyon veya flokülasyon olarak da adlandırılır), aynı tipteki bakteriler, sonunda kültür tüplerinin dibine yerleşen veya hedef dokularına veya yüzeylerine^yapışan çok hücreli kümeler oluşturur 1.

Otoagregasyon yaygın olarak gözlenen bir fenomendir ve şimdiye kadar fırsatçı patojen Acinetobacter baumannii², diş patojeni Aggregobacter actinomycetemcomitans³ ve ortaya çıkan patojen Burkholderia pseudomallei⁴ gibi Gram negatif patojenlerde gösterilmiştir. Otoagregasyon ayrıca birkaç probiyotik Gram-pozitif suşta 5,6,7,8 tanımlanmıştır. Lactobacillus (L.) acidophilus'ta, otoagregasyona kısmen S-tabakası proteinleri aracılık etti ve ksilan^7'ye bir yapışma ile ilişkilendirildi. Benzer şekilde, glikoza bağlı otoagregasyon ile probiyotik türlerin yapışkan özelliklerinin indüksiyonu arasında bir korelasyon bulduk (müsine yapışma ile değerlendirildiği gibi) Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei ve Lactiplantibacillus plantarum⁵. Artan otoagregasyon, büyük olasılıkla, glikoz ve katabolitlerine yanıt olarak hücresel adezinlerin ekspresyonundaki değişiklikleri yansıtıyordu⁹. Otoagregasyonun moleküler mekanizmaları henüz belirlenmemiş olsa da, bu işlemin agrega edilmiş bakterilerin fenotipini değiştirdiği ve onlara çevresel stres faktörlerine 1 karşı gelişmiş tolerans^ve ayrıca çekirdek algılama moleküllerine¹⁰ karşı artan hassasiyet sağladığı gösterilmiştir.

Otomatik toplamayı ölçmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır; Deneysel bir yaklaşım, kültürlerin belirli bir süre boyunca dar kültür tüplerinde statik olarak durmasına izin vermektir. Kontrol kültürleri bulanık kalırken, otoagregasyon kültürleri tüpün dibine yerleşecektir. Daha kantitatif bir yaklaşım, sedimantasyon veya çökeltme tahlili ile otoagregasyonu ölçer¹¹.

Akış sitometrisi de son yıllarda bakteriyel otoagregasyonu araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yöntem, boyutu yaklaşık 0,5 ila 1000 μm arasındaki partikülleri analiz etmek için uygundur. Tek bakteri veya oluşan agregalar sıvı içinde süspanse edilir, bir akıntıya beslenir ve tek tek tespit edilebilir¹¹. Öne doğru saçılan ışığın kaydedilmesi, hücrenin veya agreganın göreceli boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Nispeten hızlı ve basittir, ancak toplam boyutu veya agregalardaki ortalama hücre sayısı gibi çeşitli parametreleri algılayamaz. Bu nedenle, bu yaklaşım mikroskobik olarak tamamlanabilir ve daha fazla parametrenin kontrol edilmesine izin verir¹². Bununla birlikte, geleneksel mikroskopi zaman alıcıdır ve bu nedenle test edilen numunelerin sayısını ve analizin istatistiksel gücünü sınırlar. Genel olarak, görüntüleme akış sitometrisi, hücre morfolojisi ve fenotipin eşzamanlı analizi, görüntü tabanlı analiz yapma, nadir olayları tespit etme ve akış sitometrisi verilerinin doğrulanması gibi geleneksel akış sitometrisine kıyasla çeşitli özellikler sağlar¹³. Bu avantajlar, akış sitometrisinin yeteneklerini geliştirir ve hücre popülasyonlarının daha ayrıntılı bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır.

Bu çalışma, laktik asit bakterilerinde (LAB) otoagregasyonu izlemek için görüntüleme akışı sitometrisi için değerli bir protokol sağlar. Bu Gram pozitif çubuklar fakültatif anaeroblardır ve LAB grubuna aittir. Bu verimli glikoz fermentörleri, karbonhidrat metabolizmasının ana son ürünü olarak laktik asit üretir¹⁴. Bu bakteriler mikrobiyomun faydalı çekirdek üyeleridir ve doğal olarak insanların ve hayvanların gastrointestinal sisteminde (GIT) ve ayrıca dişilerin ürogenital sisteminde bulunur¹⁵. Bu nedenle, otoagregasyon özelliklerinin kesin karakterizasyonu yüksek biyoteknolojik ve klinik ilgi çekicidir.

Önceki bulgularımız, bazal otoagregasyon seviyesinin farklı probiyotik suşlar arasında farklılık gösterdiğini göstermiştir. Bu heterojenlik, karbon kaynağı olarak kullanılan farklı karbonhidratlardan etkilenir⁵. Probiyotik bakterilerin bu temel özelliğinin üstesinden gelmek için, diyetteki karbonhidratların etkileri, IFC kullanılarak tek hücre düzeyinde otoagregasyon üzerinde izlendi. Bu IFC tabanlı yaklaşım, geleneksel akış sitometrelerinin gücünü ve hızını mikroskobun çözünürlüğü ile birleştirir. Bu nedenle, fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümlere izin verir^16,17. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunu izlemek için floresan raportörlerle birleştirilen diğer probiyotik ve patojenik bakterilere ve heterojen agregalarda spesifik bakteri türlerinin varlığını ve bolluğunu izlemek için floresan etiketli suşlara genişletilebilir.

Protokol

Örnek olarak Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) şablonunu içeren .ast dosyası, Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır.

1. Medya hazırlığı

1. Üreticinin talimatlarına göre Lactobacilli MRS suyunu (1 L deiyonize suda 55 g) ve %1.5 (a/h) agar içeren Lactobacilli MRS agar plakalarını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Otoklav sterilizasyonundan sonra, ortam doğrudan kullanıma hazırdır veya 4 °C'de saklanabilir.
2. % 50 (1 L deiyonize suda 15 g) Triptik soya suyu (TSB) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız), TSB %1 (a/h) D- (+) - glikoz ve% 1 (a / h) D- (+) - rafinoz ile desteklenmiş, ardından ortamı sterilize etmek için otoklavlayın. Kirlenmeyi önlemek için 4 °C'de saklanması tercih edilir.
3. Glikozlu tamponlu bir ortam için,% 1 (a / h) D - (+) - glikoz, potasyum dibazik ile birlikte 5 mM potasyum fosfat monobazik ve 100 mM MOPS (3- (N-morfolino) propan sülfonik asit ile desteklenmiş TSB'yi hazırlayın, bkz. Daha sonra ortamı sterilize etmek için otoklavlayın.

2. Numunelerin hazırlanması

NOT: Bu adım, diyetimizden fermente edilebilir veya fermente edilemeyen şekere yanıt olarak hücresel agregasyonun değerlendirilmesini içerir. Numune hazırlama işleminin şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. Lactobacillaceae suşunu donmuş bir gliserol stoğundan (%50 gliserol) bir Lactobacilli MRS et suyu plakasına (%1.5 agar) koyun.
   NOT: Burada sunulan örnek deneyde, Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) ve Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) probiyotik suşları kullanılmıştır. Bu metodolojiyi firmicutes filumunun ek probiyotik üyelerine genişletmek için Bacillus coagulans (ATCC 10545) seçildi.
2. Hücreleri statik koşullar altında gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
3. 5 mL Lactobacilli MRS suyunu tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca statik koşullar altında 37 °C'de büyütün.
4. Önceki adımdaki hücre kültürünü (1:100) 3 mL %50 Triptik soya suyu (TSB), %1 (a/h) D- (+) - glikoz ile takviye edilmiş TSB veya %1 (a/h) D- (+) - rafinoz ile takviye edilmiş TSB içinde seyreltin.
5. Statik koşullar altında gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
6. Hücreleri ortamda homojen bir şekilde karıştırarak numuneyi hazırlayın ve hücre kültürü tüpünü adım 2.5'ten itibaren nazikçe girdaplayın. Tam karıştırma gerçekleşene kadar test tüpünü yavaşça ters çevirin. 200-300 μL'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Agregaların kırılmasını önlemek için numuneyi sonikasyon yapmamak önemlidir. Adım 3.4'ten 3.10'a kadar olan veri toplama sırasında, numunelerin çok konsantre olduğu durumlar olabilir. Numunenin çok yavaş çalıştığı veya hiç çalışmadığı gözlemlenirse, numune uygun taze ortam ile seyreltilebilir.

3. Veri toplama

1. Görüntüleme akış sitometresini üretici tarafından sağlanan talimatlara göre ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Karanlık alan ölçümü için 785 nm lazeri 5 mW'a ayarlayın (SSC olarak kısaltılan geleneksel akış sitometrisindeki yan saçılmaya eşdeğerdir). Sayısal diyafram açıklığı (N.A) 0,9 olan 60x lens kullanın, yüksek hassasiyeti seçin ve hızı düşük olarak ayarlayın.
3. Herhangi bir veri toplamadan önce, SSC kanalındaki kalibrasyon boncukları akışının kararlılığından emin olun. "Fluidics" kutusundaki oynat düğmesine tıklayın ve boncuk görüntülerinin kalitesini inceleyin. Boncuk görüntüleri keskin ve net görünmelidir.
4. Yükle düğmesine basın ve s'yi içeren bir tüp yerleştirin.ample (adım 2.6'dan itibaren) tutucuya.
5. "Çalışma alanı" kutusunda yeni bir dağılım grafiği oluşturun. Yeni dağılım grafiği'ni tıklatın ve parlak alan kanalında SSC kanal yoğunluğuna karşılık gelen alanı seçin. Numune ile birlikte cihazda çalışan kalibrasyon boncuklarını hariç tutun.
   NOT: Boncuklar, yalnızca tamponlu bir numune yüklenerek ve boncukları Alan vs. SSC arsası. Ardından, Çokgen Bölgesi Oluştur düğmesini kullanarak boncuk popülasyonunun etrafına bir kapı çizin.
6. "Edinme Ayarları" kutusuna örnek adını girin, veri depolamanın konumunu belirtin, kaydedilecek popülasyonu (boncuksuz tüm hücreler) seçin ve toplanacak olay sayısını ayarlayın. Tipik olarak, 10.000-20.000 olay yeterlidir.
7. "Edinme" kutusunda bulunan Kaydet düğmesini tıklayın ve belirtilen olay sayısına ulaşıldığında edinme işlemi otomatik olarak sona erecektir.
8. Tüpü boşaltmak için Geri Dön düğmesine tıklayın ve küçük bir pencerede istendiğinde tüpü tutucudan çıkarın.
9. Her örnek için 3.5-3.9 adımlarını tekrarlayın.
10. Sonraki tekrarlar için veri alımının tekdüzeliğini korumak için şablonu kaydedin.

4. Veri analizi

1. Popülasyondan otomatik toplamanın yüzdesini (%) ölçün.
   1. IDEAS yazılımını kullanarak görüntüleme akış sitometresinde elde edilen verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Ham dosyadan (.rif) bir veri çözümleme dosyası (.daf) oluşturun ve bu dosya (.rif) dosyasını çözümleme yazılımına yükleyin. Dosya düğmesine tıklayın ve gerekli (.rif) dosyasını açın. Açılan pencerede, edinme analizini kullan'a tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.
   3. Odaklanılan olayları belirlemek için parlak alan kanalında bir gradyan RMS histogramı (görüntü kontrastı ve odak ölçümü) oluşturun. Analiz alanında, Yeni Histogram düğmesine tıklayın. "Yeni Histogram" penceresinde, analiz etmek için alımdan popülasyonu seçin ve "x ekseni özelliği"nde, parlak alan kanalının Gradyan RMS'sini seçin.
      1. Odaklanmamış olayları hariç tutmak için analiz alanındaki Çizgi Bölgesi Oluştur düğmesine tıklayarak bir geçit yerleştirin (Şekil 2A).
         NOT: Tipik olarak, "Odaklanmış" çizgi bölgesi, en yüksek Gradyan RMS puanına sahip olayların %80-%90'ını içermelidir, ancak her deney kurulumu için "odak" hücreleri için belirli eşikler belirlenmelidir.
   4. Parlak alan kanalının en boy oranıyla (genişlik bölü en uygun elipsin uzunluğu) karşılaştırılarak alanın (μm²) bir dağılım grafiği oluşturun. Analiz alanındaki Yeni Dağılım Grafiği düğmesine basın. "Yeni Dağılım Grafiği" penceresinde, 4.1.3 adımındaki Odaklanmış popülasyonu seçin.
      1. X ekseni unsuru için parlak alan kanalının Alanı'nı ve y ekseni unsuru için parlak alan kanalının En Boy Oranı'nı seçin. Bu dağılım grafiği, tekilleri ve küçük agrega olaylarını daha büyük mikrobiyal agregalardan ve zincirlerden ayırt etmek için odaklanmış popülasyon üzerinde geçit oluşturmaya izin verir.
   5. Bu dağılım grafiğinde, Dikdörtgen Bölge Oluştur düğmesini (veya Çokgen Bölgesi Oluştur) kullanarak, toplama olayları popülasyonu için alan değerine ve tekiller ve küçük agregalar popülasyonu için başka bir geçit çizin (Şekil 2B).
      NOT: Bazı arka planlarda, küçük agregaları tekillerden ayırmak zor olabilir, bu nedenle aynı kapıda birleştirilebilirler. Aynısı daha büyük agregalar ve zincirler için de geçerlidir (Şekil 3).
   6. Geçit stratejisinin güvenilirliğini doğrulamak için her kapıdaki olayların görüntülerini manuel olarak inceleyin ve değerlendirin. Gerekirse, kapının alan değerini ayarlayın. Bunu, "Popülasyonlar" açılır menüsünden incelenen popülasyonu seçerek gerçekleştirin.
      NOT: Geçit, analiz edilen bakterinin özelliklerine bağlı olarak değişebileceğinden, belirli bir alan değerine sahip değildir.
   7. Veri analizini şablon olarak kaydedin. Dosya sekmesine tıklayın, Template.ast Olarak Kaydet'i seçin ve veri çözümleme dosyasını (.daf) oluşturmak için aynı şablon altında sonraki örnek (.rif) dosyasını açın (LGG örneği olarak .ast dosyasını destekler).
   8. Daha fazla analiz için önemli olayları numaralandırmak üzere bir istatistik tablosu oluşturun. Raporlar sekmesine tıklayın, ardından İstatistik Raporunu Tanımla'ya tıklayın.
   9. Yeni pencerede, Sütun Ekle'ye tıklayın. Singlets/aggregates sayısını ve %gated istatistiklerini ekleyin. "İstatistikler" bölümünün altında %gated/count'ı seçin ve seçili popülasyonun altında singlets/aggregates'i seçin. İstatistiği listeye eklemek ve şablon olarak kaydetmek için İstatistik Ekle'yi tıklayın.
   10. İstatistik raporu oluştur'a tıklayın ve analiz için istatistik şablonunu ve (.daf) dosyalarını seçin.
2. Agregaların boyut dağılımını ölçün.
   1. Toplama olaylarının ortalama boyutunu analiz etmek için, adım 4.1.5'teki toplama olayları popülasyonunun alanının (μm²) histogramını çizin (Şekil 2C).
   2. Veri analizini şablon olarak kaydedin. Dosya sekmesine tıklayın, Şablon Olarak Kaydet'i seçin ve veri çözümleme dosyası (.daf) için aynı şablon altında sonraki örnek (.rif) dosyasını açın.
   3. 4.1.7-4.19 adımlarını tekrarlayın. Toplamaların boyutu için, istatistikler'in altında ortalama'yı seçin ve seçili popülasyonun altındaki toplamaları seçin. Özellikler altında, Parlak alan kanalının alanı'nı seçin. İstatistiği listeye eklemek ve şablon olarak kaydetmek için İstatistik Ekle'ye tıklayın.
   4. Bir istatistik raporu oluşturmak için adım 4.1.9'u tekrarlayın.

Sonuçlar

Sonuçlar, bu yöntemin LAB bakterilerindeki diyet şekerlerine yanıt olarak otoagregasyondaki farklılıkları kolayca ölçebildiğini göstermektedir. Yöntem, bireyleri agregalardan ayırarak, diyetten fermente edilebilir veya fermente edilemeyen şekerlere yanıt olarak tüm olaylardan agregasyon olaylarının popülasyonunun yüzdesinin hesaplanmasına izin verir. Ek olarak, tedaviler arasında toplam popülasyonun ortalama büyüklüğünde farklılıklar olup olmadığını ölçmek mümkün olmuştur.

Tartışmalar

Akış sitometrisi, ökaryotik hücrelerde floresan yoğunluklarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak daha büyük boyutları veya küçük agregaları nedeniyle bakteri hücreleri için doğru ölçümler sağlayamayabilir. Bu faktörler, farklı koşullarda otoagregasyonun kesin miktar tayinini ve bazal agrega oluşumu seviyesini önemli ölçüde etkileyebilir. Bunu ele almak için, karbonhidratların probiyotik bakterilerin agregasyonunu nasıl etkilediğine dair daha iyi bir çözün?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G