Ex Vivo (Canlı Canlı) Drosophila Epilepsi Modeli için Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Burada, epileptiform aktiviteleri izlemek için GCaMP6 eksprese eden yetişkin Drosophila'da ex vivo kalsiyum görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila'daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.

Özet

Epilepsi, dünya çapında 70 milyondan fazla kişiyi etkileyen, kısmen genetik kökenle ilişkili, tekrarlayan nöbetlerle karakterize nörolojik bir hastalıktır. Epilepsinin klinik önemine rağmen, merkezi sinir sistemindeki nöral aktivitenin fonksiyonel analizi hala geliştirilmemiştir. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, GCaMP6 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin kararlı ekspresyonu ile birlikte, hem beyin çapında hem de tek hücreli çözünürlük seviyelerinde epilepsi çalışmalarında devrim yaratmıştır. Drosophila melanogaster, karmaşık moleküler genetiği ve davranışsal tahlilleri nedeniyle epilepsinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, GCaMP6 eksprese eden erişkin Drosophila'da epileptiform aktiviteleri izlemek için ex vivo kalsiyum görüntüleme için yeni ve etkili bir protokol sunuyoruz. Tüm beyin, iyi bilinen bir epilepsi geni olan cac'den hazırlanır, nöral aktiviteyi patlamaya duyarlı nöbet benzeri davranış testinin bir devamı olarak tanımlamak için konfokal mikroskopla kalsiyum görüntüleme için nakavt sinekleri. Cac knockdown sinekleri, vahşi tip sineklere göre daha büyük sivri uçlar ve daha az küçük sivri uçlar dahil olmak üzere daha yüksek oranda nöbet benzeri davranış ve anormal kalsiyum aktiviteleri gösterdi. Kalsiyum aktiviteleri nöbet benzeri davranışla ilişkiliydi. Bu metodoloji, epilepsi için patojenik genlerin taranmasında ve hücresel düzeyde epilepsinin potansiyel mekanizmasının araştırılmasında etkili bir metodoloji olarak hizmet eder.

Giriş

Spontan ve provoke edilmemiş nöbetlerin ve anormal nöronal ağ aktivitesinin nüksü ile karakterize karmaşık bir kronik nörolojik bozukluk olan epilepsi, dünya çapında 70 milyondan fazla kişiyi etkileyerek onu en yaygın nörolojik hastalıklardan biri haline getirmiştir¹ ve ailelerin ve toplumun ağır yüklerine yol açmaktadır. Epilepsinin etkisi göz önüne alındığında, genetiği birçok epilepsi veya epileptik sendrom tipinin birincil nedeni olarak onaylanan nöbetlerin etiyolojisini belirlemek için birçok çalışma yapılmıştır². Son on yıllarda, genomik teknolojilerdeki ilerlemeler, iyon kanalları ve iyon kanalı olmayan genler

Protokol

1. Patlamaya duyarlı test için protokol

1. Gal4/UAS sistemi²¹ üzerinden tub-Gal4 sürücü hattını UAS-cac-RNAi hattıyla geçerek deneysel sinekleri oluşturun. Tub-Gal4 hattının bakire sineklerini ve UAS-cac-RNAi hattının erkek sineklerini toplayın. Daha sonra, yavruları hasat etmek için bakire ve erkek sinekleri aynı şişeye aktarın.
   NOT: tub-Gal4 sürücü hattı, cac geninin küresel olarak yıkılmasına izin verecektir. Kontrol grubu olarak UAS-cac-RNAi hattını kullanın.
2. 3-5 günlük eklosiyondan sonra,% 100 CO₂ (CO₂ anestezi ekipmanı....

Tartışmalar

Kalsiyum iyonu, hem kimyasal hem de elektriksel bozulmalara karşı bir dizi fizyolojik ve patofizyolojik yanıtta çok önemli bir rol oynayan çok önemli bir ikinci haberci olarak hizmet eder. Ayrıca, insan CACNA1A geni tarafından kodlanan presinaptik P/Q kanallarının topolojik elemanının, glutamat^30,31,32 dahil olmak üzere çeşitli nörotransmiterlerin deşarjına aracılık etmekten sorumlu olduğu ve epile.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background