Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Özet

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Özet

Aynı hücreli/eşleştirilmiş tek hücreli RNA- ve dizileme (ATAC-dizileme) verileriyle transpozaz erişilebilir kromatin tahlili sağlayan çoklu dizileme, tümör hücresi heterojenliğini ayırt etme yeteneğimizde bir atılımı temsil ediyor - şu anda translasyonel kanser araştırmalarının birincil odak noktası. Bununla birlikte, bu gelişmiş modalite kullanılarak elde edilen sıralama verilerinin kalitesi, büyük ölçüde girdi malzemesinin kalitesine bağlıdır.

Kaliteden ödün vermeden hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için sindirim koşullarının optimize edilmesi gerekir. Bu, hücre salınımı için nazikçe parçalanması gereken yoğun desmoplastik matrislere sahip katı tümörler bağlamında özellikle zordur. Katı tümör dokusundan yeni izole edilmiş hücreler, hücre hatlarından izole edilenlerden daha kırılgandır. Ek olarak, izole edilen hücre tipleri heterojen olduğundan, toplam hücre popülasyonunu destekleyecek koşullar seçilmelidir.

Son olarak, nükleer izolasyon koşulları, lizis süreleri ve reaktif türleri/oranları açısından bu niteliklere göre optimize edilmelidir. Bu yazıda, katı tümör örneklerinden 10x Genomics multiomum dizileme platformu için nükleer izolasyon deneyimimizi açıklıyoruz. Doku sindirimi, tek hücreli süspansiyonların saklanması (istenirse) ve nükleer izolasyon ve değerlendirme için önerilerde bulunuyoruz.

Giriş

Tümör biyolojisi hakkındaki bilgimiz arttıkça, tümör mikroçevresindeki heterojen hücreleri analiz etmenin önemi de artmıştır ^1,2. Tek hücreli RNA elde etme yeteneği ve aynı hücreden eşleştirilmiş hücre tarzında (multiomlu dizileme) dizileme (ATAC-dizileme) verileriyle transpozaz erişilebilir kromatin testi, bu amaca doğru önemli bir ilerleme sağlar ^3,4. Bununla birlikte, bu deneyler pahalı ve zaman alıcıdır ve elde edilen verilerin kalitesi ve etkisi, deney koşullarının ve malzemelerinin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Çekirdek izolasyonu için standa....

Protokol

İnsan pankreas kanseri (pankreatik duktal adenokarsinom) örnekleri laboratuvarımızda IRB onaylı bir protokole göre alındı. Doku toplanması için hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Doku ameliyathaneden laboratuvara taşındı ve daha sonra aşağıdaki gibi işlendi.

1. Doku ayrışması (sindirim)

1. Özet Tamponu Hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Tümör eksizyonundan sonra mümkün olan en kısa sürede ilgilenilen dokuyu elde edin ve numuneyi söndürme tamponunda (~% 5 fetal sığır serumu ile DMEM F-12) veya buz üzerinde 1x PBS'de taşıyın.
3. 90 mm'lik bir Petri kabında 3-5 mL Digest Buff....

Tartışmalar

Tümör mikroçevresinde bulunan heterojen hücre popülasyonlarının çözülmesi, kanser biyolojisinde aktif bir odak alanıdır. Benzer şekilde, yara iyileşmesi ve fibrozis gibi iyi huylu patolojilerde karmaşık dokular bulunur. Çoklu dizileme, aynı hücreli eşleştirilmiş scRNA ve ATAC-seq verilerinin elde edilmesine izin veren güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, taze, kırılgan, küçük tümör örneklerinin işlenmesi ortamında optimizasyon gerektiren çekirdeklerin izolasyonunu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113