Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Özet

Aynı hücreli/eşleştirilmiş tek hücreli RNA- ve dizileme (ATAC-dizileme) verileriyle transpozaz erişilebilir kromatin tahlili sağlayan çoklu dizileme, tümör hücresi heterojenliğini ayırt etme yeteneğimizde bir atılımı temsil ediyor - şu anda translasyonel kanser araştırmalarının birincil odak noktası. Bununla birlikte, bu gelişmiş modalite kullanılarak elde edilen sıralama verilerinin kalitesi, büyük ölçüde girdi malzemesinin kalitesine bağlıdır.

Kaliteden ödün vermeden hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için sindirim koşullarının optimize edilmesi gerekir. Bu, hücre salınımı için nazikçe parçalanması gereken yoğun desmoplastik matrislere sahip katı tümörler bağlamında özellikle zordur. Katı tümör dokusundan yeni izole edilmiş hücreler, hücre hatlarından izole edilenlerden daha kırılgandır. Ek olarak, izole edilen hücre tipleri heterojen olduğundan, toplam hücre popülasyonunu destekleyecek koşullar seçilmelidir.

Son olarak, nükleer izolasyon koşulları, lizis süreleri ve reaktif türleri/oranları açısından bu niteliklere göre optimize edilmelidir. Bu yazıda, katı tümör örneklerinden 10x Genomics multiomum dizileme platformu için nükleer izolasyon deneyimimizi açıklıyoruz. Doku sindirimi, tek hücreli süspansiyonların saklanması (istenirse) ve nükleer izolasyon ve değerlendirme için önerilerde bulunuyoruz.

Giriş

Tümör biyolojisi hakkındaki bilgimiz arttıkça, tümör mikroçevresindeki heterojen hücreleri analiz etmenin önemi de artmıştır 1,2. Tek hücreli RNA elde etme yeteneği ve aynı hücreden eşleştirilmiş hücre tarzında (multiomlu dizileme) dizileme (ATAC-dizileme) verileriyle transpozaz erişilebilir kromatin testi, bu amaca doğru önemli bir ilerleme sağlar 3,4. Bununla birlikte, bu deneyler pahalı ve zaman alıcıdır ve elde edilen verilerin kalitesi ve etkisi, deney koşullarının ve malzemelerinin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Çekirdek izolasyonu için standartlaştırılmış protokoller yayınlanmıştır 5,6. Katı tümör örneklerinden yeni izole edilen hücreler, hücre hatlarından izole edilenlerden daha kırılgan olduğundan, taze ve heterojen dokular protokol optimizasyonu gerektirir.

Diğer bir husus, katı tümörler için cerrahi örneklerin genellikle ameliyathaneden günün geç saatlerine kadar temin edilememesidir. Bu nedenle, bir kriyoprezervasyon adımı olmadan doğrudan numune alımından çekirdek yakalamaya geçmek genellikle mümkün değildir. Deneyimlerimize göre, tek hücreli bir süspansiyonun dondurulması, en yüksek kalitede çekirdekleri verir (hızlı donmuş tüm doku veya diğer koruma yöntemleri yerine). Bu, özellikle pankreas gibi yüksek RNaz içeriğine sahip enzimatik doku tipleri için geçerlidir.

Doku sindirim koşullarının da kaliteden ödün vermeden hücre verimini en üst düzeye çıkaracak şekilde tasarlanması gerekir7. Yoğun desmoplastik matrislere8 sahip katı tümör tipleri bağlamında, hücre dışı matrisin hücre salınımı için nazikçe parçalanması gerekir. Ek olarak, izole edilen hücre tipleri heterojen olduğundan, koşullar toplam hücre popülasyonunu destekleyecek şekilde ayarlanmalıdır. Açıklanan protokolde insan pankreas kanseri (pankreatik duktal adenokarsinom) örnekleri kullanılmaktadır. Pankreas kanseri, nispeten yapışkan doku ve hücrelere işaret eden oldukça desmoplastik bir tümör tipini temsil eder. Ayrıca, araştırma için mevcut pankreas tümörü örnekleri de nispeten küçük olma eğiliminde olduğundan, yakalanan hücre miktarını en üst düzeye çıkarmak için çaba sarf edilmektedir.

Çekirdeklerin izolasyonu, hücre lizis koşulları ve zamanlamasının yanı sıra reaktif türleri ve oranları açısından en fazla optimizasyonu gerektirir. Çekirdeklerin izolasyon sırasında ele alınması da büyük özen gerektirir. Bu makalede, katı tümör dokusundan 10x Genomics multiom dizileme platformu için nükleer izolasyonu optimize etme deneyimimizi açıklıyoruz (Şekil 1). Doku sindirimi, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması (istenirse) ve nükleer izolasyon için önerilerde bulunuyoruz.

Protokol

İnsan pankreas kanseri (pankreatik duktal adenokarsinom) örnekleri laboratuvarımızda IRB onaylı bir protokole göre alındı. Doku toplanması için hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Doku ameliyathaneden laboratuvara taşındı ve daha sonra aşağıdaki gibi işlendi.

1. Doku ayrışması (sindirim)

  1. Özet Tamponu Hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Tümör eksizyonundan sonra mümkün olan en kısa sürede ilgilenilen dokuyu elde edin ve numuneyi söndürme tamponunda (~% 5 fetal sığır serumu ile DMEM F-12) veya buz üzerinde 1x PBS'de taşıyın.
  3. 90 mm'lik bir Petri kabında 3-5 mL Digest Buffer'da temiz forseps ve makas kullanarak dokuyu kıyın (Şekil 2A).
  4. Kıyılmış dokuyu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve çalkalama fonksiyonlu bir su banyosu veya kuru bir karıştırıcı kullanarak 37 ° C'de 30 dakika boyunca ~ 10 mL Sindirim Tamponu içinde ayrışın.
  5. Karıştırıcıdan çıkarın ve ~20 mL söndürme ortamı ile söndürün. Çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden temiz bir konik tüpe süzün.
  6. Süzgeçten kalan katı dokuları toplayın (gerekirse kalan doku parçalarını yeniden kıyın) ve ~10 mL taze Digest Buffer'a 30 °C'de 37 dakika daha çalkalayarak koyun. Tüm tümör dokusu ayrışana kadar tekrarlayın.
  7. Havuz hücresi süspansiyonu alikotları ve 70 μm'lik bir süzgeçten ve ardından 40 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir konik tüpe süzün.
  8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da pelet hücrelerine santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltın.

2. Kriyoprezervasyon

  1. Peleti 1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse ederek hücreleri durulayın.
  2. Hücre süspansiyonunu (optimum dondurma için ~ 1-10 milyon hücre / tüp) buz üzerinde 1.5 mL'lik bir kriyoviyal'e aktarın.
  3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da pelet hücrelerine santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltın.
  4. Hücreleri 1 mL Bambanker çözeltisinde yeniden süspanse edin, 1.5 veya 2 mL'lik bir kriyoviyal'e aktarın (Şekil 2B) ve -80 °C'de -1 °C/dk soğutma hızı dondurma kabı (%100 izopropil alkol içerir) kullanarak dondurun veya numunenin daha uzun süreli depolanması bekleniyorsa sıvı nitrojene aktarın.

3. Çekirdek izolasyonu

  1. Hücre süspansiyonunun kriyoviyalini hızla çözün ve ıslak buzun üzerine yerleştirin.
  2. Çözülmüş hücre süspansiyonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri durulamak için şişeyi 1x PBS ile 2 mL'lik çözeltiye doldurun.
  3. Hücrelerin hem miktarını hem de kalitesini değerlendirmek için bir hemositometre kullanarak manuel hücre sayımı elde edin (Şekil 2C).
  4. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da pelet hücrelerine santrifüjleyin ve ardından kuru bir pelet bırakmak ve buz üzerinde tutmak için giderek daha küçük pipet uçları kullanarak süpernatanı nazikçe boşaltın.
    1. Tüm santrifüjleme adımları için döner kovalı rotor kullanın. Maksimum hücre verimi için, tüpleri menteşe dışa bakacak şekilde santrifüje yerleştirin ve ardından pipet ucu tüpün karşı tarafına doğru bakacak şekilde boşaltın (Şekil 2D).
      NOT: Süpernatanı boşaltmak için, boşaltılan sıvı hacmini en üst düzeye çıkarırken peletin bozulmasını sınırlamak için sıvıyı çıkarmak için giderek daha küçük pipet uçları kullanın. Bu strateji, çekirdek peleti genellikle görünmediğinden, çekirdek ekstraksiyonunu takip eden protokolde özellikle yararlıdır.
  5. 1x Hücre Lizis Tamponu, Hücre Lizis Seyreltme Tamponu ve Yıkama Tamponu (Şekil 3A) yayınlanan protokole göre aşağıdaki değişikliklerle hazırlayın (bkz. Tablo 1, Malzeme Tablosu):
    NOT: Çökeltiyi çözmek için kullanmadan önce Digitonin'i 65 °C'de bir ısıtma bloğuna yerleştirin (Şekil 3B). Bu genellikle yaklaşık 10 dakika sürer.
  6. 100 μL 1x Hücre Lizis Tamponu ve 900 μL Hücre Lizis Seyreltme Tamponunu birleştirerek 0.1x Hücre Lizis Tamponunu hazırlayın, karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve buz üzerine yerleştirin.
  7. Hücre peletini 100 μL soğutulmuş 0.1x Hücre Lizis Tamponu içinde yeniden süspanse edin ve 5x karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
  8. Buz üzerinde 3 dakika inkübe edin (Şekil 3C).
  9. 1 mL soğutulmuş Yıkama Tamponu ekleyin ve 5x hafifçe karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
  10. Çekirdekleri 500 °C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da peletlemek için santrifüjleyin, süpernatanı yavaşça kuru bir pelete boşaltın ve buz üzerinde tutun.
    NOT: Başlangıç hücre sayısı düşükse (100.000-200.000 hücre), tüp yüzey alanını azaltmak ve kayıpları en aza indirmek için hücre lizis ve yıkama adımlarını 2 mL mikrosantrifüj tüpü yerine 200 μL'lik bir PCR tüpünde gerçekleştirin. Bu durumda, daha küçük tüp hacmine uyum sağlamak için Yıkama Tamponu hacmini azaltın.
  11. Toplam üç yıkama için Adım 3.9-3.10 2x'i tekrarlayın.
  12. Mikroskop altında bir hemositometre lamı kullanarak çekirdekleri manuel olarak sayın. Çekirdekleri görüntülemek için kontrast sağlamak ve çekirdekleri parçalanmamış hücrelerden ayırt etmeye yardımcı olmak için istenirse tripan mavisi boyası kullanın.
  13. Yayınlanan protokole göre 1x Çekirdek Tamponunu hazırlayın: 20x Çekirdek Tampon stoğu, 1 mM DTT, 1 U/μL RNaz İnhibitörü nükleaz içermeyen suda ve buz üzerinde tutun (bkz.
  14. Hedefe yönelik çekirdek geri kazanımına dayalı olarak 1x Çekirdek Tamponunda çekirdek peletini yeniden süspanse edin.
    NOT: Konsantrasyon yeterince yüksekse, beklenen 10,000 μL'lik hacim kaybı ve filtreleme ile konsantrasyonda %3,230 azalma göz önüne alındığında, başlangıç yeniden süspansiyon hacmini belirlerken bu adımda (8-25 çekirdek/μL) hedeflenen 20 veya biraz daha yüksek bir geri kazanımı hedefleyin (Adım 3.15).
  15. Yeniden asılı çekirdek hacmini 40 μm'lik bir Pipet Ucu Hücre Süzgecinden yavaşça geçirin ve çekirdekleri buzun üzerine yerleştirin (Şekil 3D).
  16. Çekirdekleri sayın (Şekil 4A-C). Gerekirse nihai çözeltiyi Nuclei Buffer ile daha da seyreltin.
  17. Çekirdekleri buz üzerinde taşıyın ve yayınlanan protokollere göre hemen çekirdek yakalamaya devam edin.

Sonuçlar

Çoklu dizileme için hasta katı tümör örneklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için (Şekil 1), tümör dokusu ayrıştı ve tek hücreli bir süspansiyon dondurularak saklandı (Şekil 2A-D). Hücre süspansiyonu daha sonra planlanan multiom yakalama sırasında çözüldü. Çekirdek yakalama, hem kaliteyi hem de verimi en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş lizis tampon reaktifleri ve zamanla...

Tartışmalar

Tümör mikroçevresinde bulunan heterojen hücre popülasyonlarının çözülmesi, kanser biyolojisinde aktif bir odak alanıdır. Benzer şekilde, yara iyileşmesi ve fibrozis gibi iyi huylu patolojilerde karmaşık dokular bulunur. Çoklu dizileme, aynı hücreli eşleştirilmiş scRNA ve ATAC-seq verilerinin elde edilmesine izin veren güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, taze, kırılgan, küçük tümör örneklerinin işlenmesi ortamında optimizasyon gerektiren çekirdeklerin izolasyonunu...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Stanford Fonksiyonel Genomik Tesisi'ne (SFGF), özellikle Dhananjay Wagh ve John Coller'a ve 10x Genomics'e deneylerimizi optimize etmedeki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser ve Byrne Lee'ye hasta örneklerinin alınmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Art ve Elaine Taylor'a, Rantz Vakfı'na ve Warren ve Judy Kaplan'a araştırma çabalarımıza cömert destekleri için teşekkür ederiz. Finansman kaynakları arasında NIH hibeleri 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (MTL), 1R01GM136659 (MTL), Goldman Sachs Vakfı (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı (D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fonu, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Stinehart/Reed Vakfı ve Hagey Pediatrik Rejeneratif Tıp Laboratuvarı. Sıralama, NIH fonlarıyla satın alınan makineler (S10OD025212, S10OD018220 ve 1S10OD01058001A1) kullanılarak elde edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers  ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)10x Genomics2000153/2000207
Bambanker Wako, Fisher ScientiticNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
Calcium ChlorideSigma Aldrich499609
Collagenase (Collagenase Type IV)ThermoFisher17104019
DigitoninThermo FisherBN2006
DNase IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12Thermo Fisher11320082
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solutionSigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit 
NaClSigma Aldrich59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container ThermoFisher5100-0001
Nonident P40 SubstituteSigma Aldrich74385
Poloxamer 188SigmaP5556
Rnase inhibitor Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20Thermo Fisher85113

Referanslar

  1. Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
  2. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  3. Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
  4. Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
  5. . Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022)
  6. . Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022)
  7. Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).
  8. Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).
  9. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  10. Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).
  11. Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
  12. Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Optimize Edilmi ekirdek zolasyonuTaze T m r rnekleriDondurulmu T m r rneklerioklu DizilemeTek H creli RNA DizilemeATAC DizilemeT m r H cresi Heterojenli iTranslasyonel Kanser Ara t rmalarDizileme Veri KalitesiSindirim Ko ullar OptimizasyonuH cre Verimi MaksimizasyonuKat T m r Desmoplastik MatrisleriH cre Sal n mK r lgan H crelerHeterojen H cre TipleriToplam H cre Pop lasyonu Deste iN kleer zolasyon Ko ullar OptimizasyonuLizis S releriReaktif Tipleri Oranlar10x Genomik oklu S ralama Platformu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır