Hücre Dışı Vezikül Doku Faktörü Aktivite Testi

Özet

Burada kurum içi hücre dışı vezikül dokusu faktör aktivite testini açıklıyoruz. İnsan plazma örneklerinden hücre dışı veziküllerdeki doku faktörünü ölçmek için aktiviteye dayalı testler ve antijen bazlı testler kullanılmıştır. Aktiviteye dayalı tahliller, antijen bazlı tahlillere göre daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir.

Özet

Doku faktörü (TF), faktör (F) VII ve FVIIa için bir transmembran reseptörüdür. TF/FVIIa kompleksi, hem FIX hem de FX'i etkinleştirerek pıhtılaşma kademesini başlatır. TF, hücrelerden hücre dışı veziküller (EV'ler) şeklinde dolaşıma salınır. Kanser, bakteriyel ve viral enfeksiyonlar ve siroz dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda TF ^{pozitif (+)} EV'lerin seviyesi artar ve tromboz, yaygın damar içi pıhtılaşma, hastalık şiddeti ve mortalite ile ilişkilidir. Plazmada TF⁺ EV'leri ölçmenin iki yolu vardır: antijen ve aktivite bazlı tahliller. Veriler, aktivite bazlı testlerin antijen bazlı testlerden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğunu göstermektedir. Bu makale, iki aşamalı bir FXa üretim testine dayanan kurum içi EVTF aktivite testimizi açıklamaktadır. TF'ye bağımlı FXa neslini TF'den bağımsız FXa neslinden ayırt etmek için anti-TF antikorunun varlığında ve yokluğunda FXa oluşturmak için TF⁺ EV içeren numunelere FVIIa, FX ve kalsiyum eklenir. FXa seviyesini belirlemek için FXa tarafından parçalanmış bir kromojenik substrat kullanılırken, TF konsantrasyonunun belirlenmesi için relipidlenmiş bir rekombinant TF ile oluşturulan standart bir eğri kullanılır. Bu kurum içi EVTF aktivite testi, ticari bir TF aktivite testinden daha yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir.

Giriş

Faktör (F) VII/VIIa'nın doku faktörüne (TF)¹ bağlanması ile kan pıhtılaşması başlatılır. TF / FVIIa kompleksi, kan pıhtılaşmasını etkinleştirmek için hem FIX hem de FX'i aktive eder¹. Tam uzunlukta, membrana bağlı TF'nin iki biçimi vardır: şifreli ve aktif. Ek olarak, alternatif olarak eklenmiş bir TF formu (asTF) vardır. Hücre zarının dış broşüründeki sfingomyelin ve fosfatidilkolin, TF'yi şifreli bir durumda^{tutar 2,3,4}. Hücreler aktive edildiğinde veya hasar gördüğünde, fosfolipid scramblase, fosfatidilserin ve diğer negatif y....

Protokol

Araştırma, Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (protokol numarası: 14-2108).

1. Bağışçılardan kan alınması

1. 21 G'lik bir iğne ile antekubital ven içine temiz damar delinmesi kullanarak tam kan toplayın. İlk 3 mL kanın atılmasını sağlayın çünkü kanın bu kısmı perivasküler hücrelerden TF içerebilir.
2. % 3.2 sodyum sitrat (0.109 mol / L) içeren bir vakutainere 2.7 veya 1.8 mL (tüplerin boyutuna bağlı olarak) kan çekin. Tüpleri fazla veya az doldurmayın. Sodyum sitratı dağıtmak için kan alımından hemen sonra tüpleri hafifçe ters çevirin.
3. Tüple....

Tartışmalar

Burada, kurum içi EVTF aktivite testimizin protokolü sunulmaktadır. Protokolde üç kritik adım vardır. EV peletini sulandırırken, görünür olmasa bile EV peletinin bulunduğu yerde yukarı ve aşağı pipetlemek önemlidir. EV peletinin eksik sulandırılması, numunelerin EVTF aktivite değerlerinin yanlış negatif veya eksik tahmin edilmesine neden olacaktır. İkinci olarak, HBSA-Ca(+) kullanmak protokol adımı 6.5'te kritik öneme sahiptir, çünkü FXa üretimi kalsiyum olmadan oluşturulamaz. Üçüncü.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55