Tendonların incelenmesi için iki foton mikroskobu

Özet

Bu makale, multifoton mikroskobu kullanılarak tendonların hazırlanması, kurulması ve görüntülenmesi sürecini özetlemektedir. Ek olarak, kollajen fibril hizalamasını analiz etmek için SHG uygulamasını ve tendonların 3 boyutlu bir temsilinin oluşturulmasını kapsar. Bu metodoloji, yaralanma ve gelişim sırasında tendon hücrelerini ve ECM'lerini karakterize etmede oldukça değerli olduğunu kanıtlamaktadır.

Özet

İki foton mikroskobu, derin doku hücrelerini değerlendirmek ve çeşitli biyolojik sistemlerde hücre dışı matrisin (ECM) hizalanmasını karakterize etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, iki farklı sinyali tespit etmek için doğrusal olmayan ışık-madde etkileşimlerine dayanır: kollajen liflerinin görselleştirilmesini ve oryantasyonlarını kolaylaştıran ikinci harmonik üretilen (SHG) difüzyon sinyali ve ultraviyole uyarılmış otofloresan görüntüleme için yakın kızılötesi uyarma sinyali.

SHG görüntüleme, fibriller kollajen I'in sentrosimetrik olmayan kristal yapısı nedeniyle kollajen liflerinin görüntülenmesinde özellikle etkili olduğunu kanıtlamaktadır. Tendonların sınırlı sayıda hücreye sahip matris açısından zengin dokular olduğu göz önüne alındığında, yüksek kollajen içeriği onları iki foton mikroskobu kullanılarak analiz için ideal adaylar yapar. Sonuç olarak, iki foton mikroskobu, tendonlardaki kollajen anormalliklerini analiz etmek ve karakterize etmek için değerli bir araç sunar. Uygulaması, tendon gelişimini, yaralanmalarını, iyileşmesini ve yaşlanmasını incelemeye kadar uzanır ve iki foton mikroskobu araçları kullanılarak tendon hücrelerinin kapsamlı karakterizasyonunu ve çeşitli koşullar altında ECM ile etkileşimlerini sağlar. Bu protokol, tendon biyolojisinde iki foton mikroskobunun kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve gelişim sırasında ve yaralanma sonrasında tendon hücrelerinin etkili bir şekilde görüntülenmesi ve karakterizasyonunun elde edilmesi için uyarlanmış bir metodoloji sunar. Yöntem, tendonlar ve bu matris ile etkileşime giren hücreler içindeki ECM'nin kapsamlı bir görüntüsünü oluşturmak için ince mikroskobik kesitlerin kullanılmasına izin verir. En önemlisi, makale, hayvan modellerinde iki foton mikroskobu kullanarak 3D görüntüler oluşturmak için bir teknik sergiliyor.

Giriş

Düzgün bir şekilde çalışması ve kuvveti kastan^{kemiğe 1} iletmesi için tendonlar, kollajen lifleri arasındaki moleküller arası ve molekül içi bağlara güvenir. Kollajen liflerinin karmaşık kendi kendine montajı, çapraz bağlanması ve hizalanması, tendon dokusunun ^2,3,4 biyomekanik mukavemetine ve esnekliğine katkıda bulunan oldukça organize bir matrisin kurulmasıyla sonuçlanır. Diğer ECM proteinleri de tendonlardaki⁵ fibriller ağın stabilitesine katkıda bulunsa da, tendon kuru kütlesi yaklaşık% 86 kollajen^6'dır ve kollajen I, toplam kollajen içeriğinin% 96'sını oluşturur ^7,8. Bu sonuçta kollajen yapısını normal tendon sağlığı ve fonksiyonunun önemli bir çıktısı haline getirir.

Tendonlar için kullanılan bazı klinik görüntüleme yöntemleri MRG ve/veya ultrasondur. Ultrason teknolojisi, tendonun fasiküler yapısının görüntülerini sağlarken ve dokudaki^{fibriler yapının bir kısmını ortaya} çıkarırken9, çözünürlük miktar tayini için ideal değildir. MRG, ultrason görüntülemeden daha iyi uzamsal çözünürlüğe sahiptir, ancak yine de sınırlıdır. Bununla birlikte, bu yöntemler aynı zamanda bir doku yoluyla potansiyel görüntüleme derinliklerinde de sınırlıdır. Daha mikro ölçekte, kollajen fibrillerinin yapısını ve olası anormallikleri değerlendirmek için küçük ve geniş açılı ışık saçılımı ve konfokal mikroskopi kullanılabilir.

Buna karşılık, ikinci harmonik nesil (SHG) mikroskobu, kollajen fibrillerinin dış kabuğunu yakalayabildiği için diğer görüntüleme yöntemlerinden farklıdır. Tendonlardaki kollajen I fibrilleri, tendon ECM boyunca tek eksenli paralel bir şekilde düzenlenir ve doğası gereği sentrosimetrik değildir ^4,10. Bu özellikler, konfokal görüntülemeden 2-3 kat daha derin net görüntüler üretebilen bir çoklu foton mikroskobu kullanılarak görüntüleme için kullanılabilir¹¹. Bu aynı zamanda tendonun daha kaliteli optik kesitlerini oluşturmamızı sağlar. İlgilenilen örneğe ışık yansıtıldığında, bir SHG sinyali üretilir ve bu ışık saçılımı yakalanabilir. Tendonlarda bu, kollajen yapısının ve hizalamasının bir görüntüsünü üretir, böylece tendinopatilerin, yaralanmaların vb. potansiyel morfolojik ve patolojik sonuçlarını değerlendirmemize olanak tanır.

Kollajen, tendon kuru kütlesinin çoğunu oluşturduğundan ve tendon fonksiyonuna katkıda bulunduğundan ^6,12, kollajen yapısının bozulması tendonların biyomekanik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, yapısını analiz etmek, yaralanmaların etkisini ve ciddiyetini daha iyi anlamamıza ve iyileşme etkinliği için bir ölçü oluşturmamıza yardımcı olabilir. Bu makale, gelişim ve yaralanmaların kollajen I fibrillerinin yapısını ve hizalamasını nasıl etkilediğini analiz etmek ve hayvan modellerinde tendon ECM'nin 3D görüntülerini oluşturmak için multifoton ve SHG mikroskobu kullanan bir yöntemi gözden geçirmektedir. Bu nedenle, tendonları görüntüleme yöntemimiz, araştırmacıların gelişim sırasında veya yaralanma sonrasında tendon hücrelerini ve ECM'yi karakterize etmelerine yardımcı olabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Massachusetts General Hospital'da Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) (Protokol #2013N0000062) ve AAALAC yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışma için Scx-GFP arka planında, 30 günlükken BHLHE40 boş nakavt veya heterozigot dişi fare kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Doku hazırlama ve fiksasyon

1. Dokuyu hazırlamak için, fareleri bir CO₂ odasında (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
2. Doku örneğine yapışabilecek kürk miktarını azaltmaya yardımcı olmak için, kürk doygunluğa ulaşana kadar fareye %70 EtOH püskürtün. Arka ayakların derisini sürün ve ardından makas kullanarak kalça eklemini keserek iki arka ayağı çıkarın.
3. İki arka ayağı 20 mL'lik bir parıldama şişesine yerleştirin ve şişenin dolması için% 4 PFA'ya daldırın. Şişeleri gece boyunca çalkalayarak 4 °C'ye yerleştirin.
4. Arka ayakları 1x PBS'de oda sıcaklığında (RT) 10 dakika çalkalayarak yıkayın ve toplam 3 kez tekrarlayın. Arka ayakları 4 ° C'de 0,5 M EDTA'ya (pH 8.0) daldırın ve 2 haftaya kadar çalkalayın ve her 2-3 günde bir taze EDTA ile değiştirin.
5. Arka ayakları RT'de 1x PBS'de 10 dakika çalkalayarak yıkayın, yıkamaları toplam 3 kez tekrarlayın.
6. Uzuvları taze 1x PBS'ye daldırın ve görüntüleme için kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.

2. Tendonun diseksiyonu ve görüntüleme için doku hazırlanması

1. Ayağı forseps ile tutarken, yaylı makasın bıçağının bir ucunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) Aşil tendonunun altına kaydırın ve miyotendinöz kavşağa mümkün olduğunca yakın kestiğinizden emin olun.
2. Tendonun kopmuş miyotendinöz ucunu forseps ile tutun ve tendonu kemiğe mümkün olduğunca yakın kesmek için yaylı makası kullanın.
   NOT: Gerekirse, ilk kesim sırasında Aşil tendonunu arka bacağın geri kalanından uzak tutmaya yardımcı olmak için forseps kullanın. Görüntüleme sırasında kollajen hizalamasını etkileyeceği için dokuyu ezmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.
3. Geçirgenlik sağlamak ve nükleer bir karşı lekeye sahip olmak için, disseke edilmiş tendonu PBT'ye (PBS'de %1 Triton-X) %0.1 Draq5 (stok konsantrasyonu, 5 mM, Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın. Tendonu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 1 mL PBT'ye 1 uL Draq5 ekleyin. Bir rocker üzerinde RT'de gece boyunca kuluçkaya yatırın. Draq5 ışığa duyarlı olduğundan, mikrosantrifüj tüplerini alüminyum folyo ile kapatın ve numuneleri ışıktan koruyun.
4. Görüntülemeden önce Draq5 solüsyonunu çıkarın ve dPBS ile değiştirin. Numuneyi ışıktan korumaya devam ettiğinizden emin olun.
   DİKKAT: Draq5, kategori üç toksisiteye sahiptir ve OSHA Tehlike İletişim Standardı tarafından tehlikeli olarak kabul edilir. Temastan kaçının ve etiketli bir atık kabına atın.
5. İç çapı 6 mm olan bir biyopsi delme aleti kullanarak, bir parça jel köpüğü kesin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 60 x 15 mm'lik küçük bir Petri kabına yerleştirin. Jel köpüğün genişlemesini sağlamak için tabağa ddH₂O ekleyin.
6. Disseke edilmiş Aşil tendonunu jel köpüğü üzerine yerleştirin. Bir rondelaya yapıştırılmış bir lamel kullanarak, lamel doku ile temas edene kadar rondelayı dikkatlice tendonun üzerine yerleştirin. Görüntüleme sırasında sorun yaşamamak için, numune ile lamel arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Gerekirse, numuneyi ve yıkayıcıyı lamel ile kaplamak için tabağa daha fazla ddH₂O ekleyin.

3. Çoklu foton mikroskobu ile görüntüleme

1. Bir FVMPE-RS çoklu foton lazer mikroskobu, suya daldırılabilen 25x objektif, HPDS-O IR darbeli lazer ve IR darbeli lazer (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak, EPI ışık yolu kullanılarak görüntülenecek numuneyi ve ilgilenilen bölgeyi bulun. Örnek bulunduktan sonra, kamerayı Aşil tendonunun miyotendinöz veya entezyal ucuna ayarlayın.
2. Işık yolunu LSH'ye getirin, Lazer 2'nin IR Lazer ayarını 840 nm'ye ayarlayın ve aktif olarak hizalayın. HV gücünü, dokuyu ve SHG sinyalini %20'yi aşmadan görebilecek şekilde ayarlayın. Kazancı ayarlamayın ve ofseti 0'a eşit tutun.
3. Ardından, örnek görüntüleri almak için z-stack parametrelerini yapılandırın. 1024 x 1024 tarama boyutu kullanın ve adım boyutunu 0,4 mikron olarak ayarlayın. Z-yığınları ortalama olarak yaklaşık 150 dilimdir ve dış kılıftan başlar ve SHG sinyali artık net olmayana kadar tendonun merkezine doğru hareket eder ve sagital optik bölümler^{üretir 13}.
4. Sinyal algılama standardizasyonuna izin vermek için lazer gücünü Parlak Z moduna ayarlayın. Z yığını başlatma/durdurma parametreleri oluşturulduktan sonra, lazer yoğunluğunu görüntülemenin başlangıcında 4 ve görüntülemenin sonunda 6 olarak ayarlayın. Bu, dürbün dokunun daha derinlerine inerken SHG sinyalinde tutarlılığın korunmasına yardımcı olur.
5. Z-yığınları oluşturulduktan sonra, enine yönde optik bölümlerden oluşan bir film oluşturmak için bunları ImageJ/FIJI'de daha fazla işleyin. Bunu yapmak için ImageJ/FIJI yazılımını¹⁴ açın ve Image > Stacks > Reslice'a tıklayın. Bu, Aşil tendonunun enine bir görünümüne sahip olmamızı sağlayacak ve tenositlerin yıldız morfolojisini ve kollajen matrisindeki yönelimlerini ortaya çıkaracaktır.

Sonuçlar

Bu protokol, tendon hücrelerini ve hücre dışı matrislerini (ECM) yaralanma sonrası, gelişim sırasında veya mutant bir durumda karakterize etmek için kullanışlıdır. Numunenin dikkatli bir şekilde diseksiyonu ve hazırlanması ile, doku boyunca sagital oryantasyonda z-stack videoları oluşturulabilir (Video 1 ve Video 2). Görüntüleri işlemek ve yeniden dilimlemek için ImageJ/FIJI kullanılarak, Aşil tendonunun enine bir görünümü o...

Tartışmalar

Bu makale, tendon ECM'nin sentrosimetrik olmayan kristal özelliklerini kullanarak fare Aşil tendonunu hazırlamak, incelemek ve görüntülemek için bir yöntem sunar. Doku hazırlamadaki temel adımlar, karşı lekeler için geçirgenliği ve görüntüleme sırasında bir petri kabına uygun doku yerleşimini sağlamayı içerir. Draq5 yerine, Hoechst 33258 1:100.000 seyreltmede¹³ kullanılabilir, ancak yüksek geçirgenliği, fotostabilitesi ve minimum fotoa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9262
2 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1620-2700
20 mL scintillation vial	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Use PFA ampuole to create 4% PFA solution
6 mm Biopsy Punch Tool	Ted Pella Inc.	15111-60
60 x 15 mm petri dish
BHLHE40 null knockout or heterozygous mice in a Scx-GFP background	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Coverslips	Fisher	12-544-F	Can use any coverslip that spans the area of the M20 washer
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Fine scissors 21 mm cutting edge	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS multiphoton laser scanning microscope	Olympus
Gelfoam Sterile Sponge Size 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR pulsed laser	Olympus
MaiTai HPDS-O IR pulsed laser	Olympus
Phosphate-Buffered Saline (1x)	Invitrogen	AM9625	Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution
Stainless steel M20 flat washer	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Dilute Triton X-100 in dPBS to get 1% solution
Vannas spring scissors 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens