JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Gastrointestinal (GI) sistem, yaşam için gerekli olan bir dizi işlevi yerine getirir. Gelişimini etkileyen konjenital kusurlar, enterik nöromüsküler bozukluklara yol açabilir ve GI gelişimi ve disfonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları anlamanın önemini vurgular. Bu çalışmada, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) analizi için kullanılabilecek canlı, canlı hücreler elde etmek için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, zebra balığı bağırsağının manuel diseksiyonuna ve ardından papain ile enzimatik ayrışmaya dayanır. Daha sonra, hücreler floresanla aktive edilen hücre sıralamasına gönderilir ve canlı hücreler scRNA dizilimi için toplanır. Bu yöntemle, epitel, stromal, kan, kas ve bağışıklık hücrelerinin yanı sıra enterik nöronlar ve glia dahil olmak üzere farklı bağırsak hücre tiplerini başarıyla tanımlayabildik. Bu nedenle, zebra balığı kullanarak sağlık ve hastalıkta GI yolunun bileşimini incelemek için değerli bir kaynak olduğunu düşünüyoruz.

Giriş

Gastrointestinal (GI) sistem, genel sağlık ve esenlikte hayati bir rol oynayan karmaşık bir sistemdir. Besinlerin sindirimi ve emiliminin yanı sıra atık ürünlerin ortadan kaldırılmasından sorumludur 1,2. GI yolu, uygun bağırsak fonksiyonunu düzenlemek ve sürdürmek için birbirine yakın iletişim kuran epitel hücreleri, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve enterik sinir sistemi (ENS) dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerinden oluşur 3,4,5. GI yolunun gelişimindeki kusurlar, besin emilimi, mikrobiyota bileşimi, bağırsak-beyin ekseni ve ENS gibi çeşitli yönler üzerinde geniş kapsamlı etkilere sahip olabilir ve Hirschsprung hastalığı ve Kronik bağırsak psödo-tıkanıklığı gibi çeşitli enterik nöromüsküler bozukluklara yol açabilir 6,7. Bu bozukluklar, Cajal'ın interstisyel hücreleri, düz kas hücreleri ve ENS 6,8,9 gibi çeşitli anahtar hücrelerdeki değişikliklerin neden olduğu şiddetli bağırsak dismotilitesi ile karakterizedir. Bununla birlikte, GI gelişimi ve işlev bozukluğunun altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Zebra balığı, hızlı embriyonik gelişimi, embriyonik ve larva aşamalarındaki şeffaflığı ve genetik izlenebilirliği nedeniyle GI gelişimi ve işlev bozukluğunu incelemek için değerli bir model organizmadır 10,11,12,13,14. Floresan proteinleri eksprese eden çok sayıda transgenik zebra balığı hattı mevcuttur. Böyle bir çizginin bir örneği, enterik nöronlar da dahil olmak üzere tüm phox2bb+ hücreleri15,16 olarak etiketlendiğinden, ENS'yi incelemek için yaygın olarak kullanılan tg(phox2bb:GFP) zebra balığıdır. Burada, tg(phox2bb:GFP) zebra balığı hattını kullanarak, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) analizi için döllenmeden 5 gün sonra (dpf) larvalarının bağırsak izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1).

Protokol

Tüm zebra balığı yetiştiriciliği ve deneyleri, Erasmus MC ve Hayvan refahı mevzuatının kurumsal yönergelerine göre yürütülmüştür. Zebra balığı larvalarının döllenmeden 5 gün sonra kullanılması, Hollanda yönetmeliklerinde belirtildiği gibi, resmi etik onay gerektirmeyen deneyler kategorisine girer.

1. Döllenmeden 5 gün sonra (dpf) yabani tip ve tg(phox2bb:GFP) larvalarının elde edilmesi

  1. Yabani tip zebra balığı yetiştiriciliğini ayarlayın ve 15 cm'lik bir Petri kabında HEPES tamponlu E3 ortamında (bundan böyle E3 olarak anılacaktır) 50 yumurta toplayın. Bu balıkları floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FAC'ler) için negatif kontrol olarak kullanın.
  2. tg(phox2bb:GFP) zebra balığının üremesini ayarlayın ve 15 cm'lik bir Petri kabında E3'te yaklaşık 300 yumurta toplayın.
  3. Döllenmiş yumurtaları E3'te (maksimum 50 yumurta/tabak) 14 saat/10 saat aydınlık/karanlık döngüsünde, 28,5 °C'de bir inkübatörde saklayın.
  4. 1 dpf'de, döllenmemiş yumurtaları çıkarın ve döllenmiş olanların 5 dpf'ye kadar gelişmesine izin verin.
  5. 1 dpf'de tg(phox2bb:GFP) larvalarını seçin.

2. Yabani tip bütün larva ayrışması

  1. 5 dpf larvasını %0.016 Trikain ile uyuşturun.
  2. 30 zebra balığını 1 mL 10x tripsin-EDTA çözeltisi içeren bir Petri kabında bir tıraş bıçağı kullanarak küçük parçalara ayırın.
  3. Doğranmış zebra balıklarını toplam hacmi 2 mL 10x tripsin-EDTA çözeltisi olan bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 3 saat buz üzerinde bırakın. Ayrışmayı uyarmak için her saat başı bir P1000 pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyin.

3. Bağırsak izolasyonu

  1. Diseksiyon mikroskobu altında% 0.016 Trikain ile uyuşturulmuş 6-10 5 dpf larvalarını% 1.8'lik bir agaroz plakasına (25 mL E3 içinde 0.45 g agaroz) yerleştirin
  2. Zebra balığının kafasına bir böcek iğnesi koyun.
  3. Bir mendil kullanarak kalan tüm E3'ü çıkarın.
  4. Diğer organları rahatsız etmeden başka bir böcek iğnesi kullanarak bağırsağı izole edin. Sarının çıkarıldığından emin olun (Ek Şekil S1A).
  5. İzole edildikten sonra bağırsağı inceleyin ve gerekirse tüm bağırsak dışı materyalleri (örneğin deri, yağ, karaciğer) çıkarın.
  6. Bağırsağı cımbızla toplayın ve buz üzerinde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    NOT: Toplam diseksiyon süresi 3 saatte tutularak en az 244 bağırsak izole edilmelidir. Bu, paralel olarak çalışan iki kişi ile mümkündür.

4. Bağırsak ayrışması

  1. Tüm bağırsakların diseksiyonundan hemen sonra, mikrosantrifüj tüpünü 30 saniye boyunca tam hızda (13.800 × g) santrifüjleyin.
  2. PBS/%10 FCS'yi çıkarın, ancak bağırsakların kurumasını önlemek için az miktarda (~100 μL) bırakın. Hücreleri ayrıştırmak için CaCl2 ve MgCl2 içeren HBSS'ye 500 μL 2.17 mg / mL papain ekleyin.
  3. Papain'i 2.5 μL sistein (1 M) ile aktive edin.
  4. Bağırsakları 37 °C'de bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin. Enzimatik doku sindirimini uyarmak için yarıya kadar (5 dakika sonra) yukarı ve aşağı pipetleyin.
  5. 0,5 mL PBS /% 10 FCS ile önceden ıslatılmış 35 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücreleri bir FACS tüpüne aktarın.
  6. 0,5 mL'lik adımlarla toplam 2 mL PBS/%10 FCS ekleyerek süzgeci yıkayın.
  7. 700 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı çıkarın ve peleti 300 μL PBS/%10 FCS'de yeniden süspanse edin.
  9. Ölü hücreleri (1: 1.000) etiketlemek için 1 μg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve FACS sırasında dışlanmalarına izin vermek için 5 dakika inkübe edin.

5. FACS zenginleştirme

  1. Akış sitometresine 3.000 hücre kaydederek sıralanmış hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için vahşi tip örneğini kullanın (Ek Şekil S1B-E).
  2. 100 μm'lik bir nozul kullanın, saflığa ayırma hassasiyetini ayarlayın ve 200 μL PBS/%5 FCS içeren toplama tüpünü FACS makinesine koyun.
  3. Bağırsakların hücre süspansiyonunu yükleyin ve çiftleri (Şekil 2B) ve ölü hücreleri (Şekil 2C) hariç tutarak canlı (DAPI-negatif), tek hücreleri toplama tüpüne (Şekil 2C) sıralayın.
    NOT: tg(phox2bb) zebra balığı için, tüm tek canlı hücreler sıralandığından, GFP+ hücrelerinin oranı yalnızca referans olarak kontrol edilir.
  4. Hücre tasnifinden sonra toplama tüpünü buz üzerinde tutun.
  5. Tripan mavisi ile canlılık kontrolü de dahil olmak üzere hücre süspansiyonunu bir hemositometre ile sayın. Uygulanabilirlik en az% 80 ise, bir sonraki adıma geçin.
  6. Hücreler artık scRNAseq (yani 10x Genomics Chromium platformu) için işlenmeye hazırdır. Örnek başına yaklaşık 20.000 hücre kullanın.

Sonuçlar

Bu protokol ile 5 dpf larvadan tüm bağırsakların başarılı bir şekilde izolasyonunu ve ayrışmasını sağladık. Papain'i ayrışma enzimi olarak kullanarak, hücre canlılığını önemli ölçüde artırdık ve 46,139 izole bağırsaktan tek, canlı hücreleri (tüm hücrelerin% 6.4'ü) içeren 244 olayın yakalanmasını sağladık (Şekil 2A). Yabani tip bütün larvalar, ayıklama işleminin optimize edilmesini sağlamak için bir kontrol olarak kullanıldı, bu da etkili hüc...

Tartışmalar

Burada, FACS kullanarak 5 dpf zebra balığı larvasının bağırsağının izolasyonu ve ayrışması için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemle, farklı bağırsak hücre tipleri, 10x Genomics Chromium platformu kullanılarak scRNA-seq ile başarıyla toplandı ve analiz edildi. Canlı ENS hücrelerinin de izole edileceğine dair bir gösterge istediğimiz için tg(phox2bb:GFP) zebra balığı hattını seçtik (Şekil 2D). Bununla birlikte, bu yöntemin diğer zebra balığı ilg...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Sophia Vakfı'nın (SSWO WAR-63) arkadaşları tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)Sigma59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
AgaroseSigma-AldrichA9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap capBD Biosciences352054
Cell Ranger v3.0.210X GenomicsN/A
DAPISigma-AldrichCat#D-9542
Dissection microscopeOlympus SZX16
FACSAria III sorter machineBD BiosciencesN/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2Gibco14025050
Insect pinsFine Science Tools26000-25
L-CysteineSigmaC7352
MS-222, TricaineSupelcoA5040-250G
PapainSigmaP4762
Seurat v3Stuart et al. (2019)N/A
Trypan blue Sigma Cat#T8154

Referanslar

  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
  22. Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır