İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Özet

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

Özet

Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sistemi gelişiminde, yaralanma yanıtlarında ve nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Bu son derece dinamik hücreler, çevresel değişikliklere hızlı tepkiler sergiler ve morfoloji, transkripsiyonel profiller ve işlevler açısından önemli heterojenlik gösterir. Glial hücrelerin sağlık ve hastalıktaki işlevlerine ilişkin anlayışımız önemli ölçüde ilerlemiş olsa da, farklı hücre popülasyonlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için hakaret veya yaralanmalar bağlamında yürütülen in vitro, hücreye özgü analizlere ihtiyaç duyulmaktadır. Yetişkin fareden hücrelerin izole edilmesi, hücrelerin patolojik koşullar altında ve belirli zaman noktalarında analizine izin verdiği için hücre hatlarına veya yenidoğan hayvanlara göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, beyin tutulumu hariç omuriliğe özgü izolasyona odaklanmak, deneysel otoimmün ensefalomiyelit, omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz dahil olmak üzere omurilik patolojilerinin araştırılmasını sağlar. Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için etkili bir yöntem sunarak, fonksiyonel, moleküler veya proteomik aşağı akış çalışmalarında potansiyel uygulamalarla acil veya gelecekteki analizleri kolaylaştırır.

Giriş

Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sisteminde (MSS) hayati roller oynayan, nöronal fonksiyonu düzenlemek, CNS gelişimine katkıda bulunmak, kan-beyin bariyerini korumak ve diğer kritik süreçlere katılmak gibi sorumlulukları kapsayan çok yönlü glial hücrelerdir 1,2,3,4 . Homeostazın korunmasındaki rollerinin yanı sıra, bu glial hücreler ayrıca yaralanma ve onarım mekanizmalarında da önemli bir rol oynar. Mikroglia, hakaret veya yaralanmaları takiben fagositik, inflamatuar ve göç etme yetenekleriyle bilinir ^5,6....

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, George Washington Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi'nde (Washington, D.C., ABD; IACUC#2021-004). Çalışmada, ticari bir tedarikçiden temin edilen ve George Washington Üniversitesi'nde bulunan 10 haftadan 5 aya kadar erkek ve dişi C57BL / 6J vahşi tip (WT) fareler kullanıldı. Protokol iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Omuriliğin hazırlanması

1. Hayvanları Avertin (steril suda 12.5 mg/mL 2,2,2-Tribromoetanol ve %2,5 2-metil-2-bütanol) kullanarak uyuşturun (bkz. Farelerde ayak parmağ....

Tartışmalar

Saf, canlı birincil hücrelerin izolasyonu, belirli hücre tiplerinin yapısını ve işlevini araştırmak için çok önemlidir. Yetişkin farede, özellikle omurilikte, mevcut protokoller genellikle yetişkin omuriliğe göre uyarlanmadığından, bu görev önemli zorluklar doğurur^10,17. Bu protokol, hücre kültürü, akış sitometrisi, histoloji ve transkriptomik çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarına uygulanabilen ver.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G