Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.
Transkriptomik, hücresel programlar ve bunların bozulmalara verdiği yanıtlar hakkında kapsamlı bilgiler elde etmeyi sağlar. Son on yılda kütüphane üretim ve sıralama maliyetlerinde önemli bir düşüşe rağmen, bu teknolojilerin uyuşturucu taraması için gerekli ölçekte uygulanması aşırı derecede pahalı olmaya devam etmekte ve bu yöntemlerin muazzam potansiyelini engellemektedir. Çalışmamız, minyatür pertürbasyon kültürlerini mini-toplu transkriptomik ile birleştiren, transkriptom bazlı ilaç taraması için uygun maliyetli bir sistem sunmaktadır. Optimize edilmiş mini-bulk protokolü, uygun maliyetli dizileme derinliğinde bilgilendirici biyolojik sinyaller sağlayarak bilinen ilaçların ve yeni moleküllerin kapsamlı bir şekilde taranmasını sağlar. Seçilen tedavi ve inkübasyon süresine bağlı olarak, bu protokol yaklaşık 2 gün içinde kütüphanelerin dizilenmesiyle sonuçlanacaktır. Bu protokoldeki birkaç duraklama noktası nedeniyle, kütüphane hazırlığı ve sıralaması zamandan bağımsız olarak gerçekleştirilebilir. Aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesi mümkündür; 384 numuneye kadar ölçüm, veri kalitesinde kayıp olmadan test edilmiştir. Optimal ilaç inkübasyon sürelerindeki değişkenlik göz önüne alınmasına rağmen, koşulların ve/veya ilaçların sayısında bilinen bir sınırlama da yoktur.
Yeni ilaçların geliştirilmesi, potansiyel ilaçların ve hedeflerinin belirlenmesini, ilaç adaylarının optimize edilmesini ve sentezlenmesini ve klinik öncesi ve klinik çalışmalarda etkinliklerinin ve güvenliklerinin test edilmesini içeren karmaşık ve zaman alıcı bir süreçtir1. İlaç taraması için geleneksel yöntemler, yani terapötik amaçlar için aday bileşiklerin kütüphanelerinin sistematik olarak değerlendirilmesi, belirli hedefler veya yollar üzerindeki etkileri test etmek için hayvan modellerinin veya hücre bazlı tahlillerin kullanılmasını içerir. Bu yöntemler ilaç adaylarının belirlenmesinde başarılı olmakla birlikte, genellikle ilaç etkinliğ....
Bu protokol, Bonn Üniversitesi'nin yerel etik kurullarının yönergelerini takip eder.
1. Tamponların, çözeltilerin ve ekipmanların hazırlanması
2. Hücre işleme
Bildirilen protokolü takiben, insan PBMC'leri tohumlandı, farklı immünomodülatör ilaçlarla muamele edildi ve farklı inkübasyon sürelerinden sonra, dizileme protokolü kullanılarak toplu transkriptomik analiz için hasat edildi (Şekil 1).
Test bileşikleri için ideal ilaç konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, tamamlayıcı deneysel stratejiler yardımıyla ve spesifik bilimsel soruya dayalı olarak bu protokolün yukarısında tanımlanmalıdı.......
İlaç keşfi ve ilaç geliştirme, toplu transkriptomiklerin sağlayabileceği hücresel süreçlerin bütünsel görünümünden büyük ölçüde yararlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle standart toplu RNA-seq protokolü ile yapılan deneyin yüksek maliyeti ile sınırlıdır ve akademik ortamlarda uygulanmasını ve endüstriyel ölçeklenebilirlik potansiyelini yasaklar.
Protokolün en kritik adımları hücre çözme ve kütüphane hazırlığının ilk adımlarıdır........
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.
J.L.S., Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) ve SCHU 950/8-1 kapsamında; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammasyon, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF tarafından finanse edilen mükemmellik projesi Diyet-Vücut-Beyin (DietBB); ve 733100 hibe numarası altında AB projesi SYSCID. M.B., DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352) tarafından desteklenmektedir. L.B., DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Proje numarası 513977171) ve Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) tarafından desteklenmektedir. BioRender.com ile oluşturulan görüntüler.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 | |
Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G | |
Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.