Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.

Özet

Transkriptomik, hücresel programlar ve bunların bozulmalara verdiği yanıtlar hakkında kapsamlı bilgiler elde etmeyi sağlar. Son on yılda kütüphane üretim ve sıralama maliyetlerinde önemli bir düşüşe rağmen, bu teknolojilerin uyuşturucu taraması için gerekli ölçekte uygulanması aşırı derecede pahalı olmaya devam etmekte ve bu yöntemlerin muazzam potansiyelini engellemektedir. Çalışmamız, minyatür pertürbasyon kültürlerini mini-toplu transkriptomik ile birleştiren, transkriptom bazlı ilaç taraması için uygun maliyetli bir sistem sunmaktadır. Optimize edilmiş mini-bulk protokolü, uygun maliyetli dizileme derinliğinde bilgilendirici biyolojik sinyaller sağlayarak bilinen ilaçların ve yeni moleküllerin kapsamlı bir şekilde taranmasını sağlar. Seçilen tedavi ve inkübasyon süresine bağlı olarak, bu protokol yaklaşık 2 gün içinde kütüphanelerin dizilenmesiyle sonuçlanacaktır. Bu protokoldeki birkaç duraklama noktası nedeniyle, kütüphane hazırlığı ve sıralaması zamandan bağımsız olarak gerçekleştirilebilir. Aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesi mümkündür; 384 numuneye kadar ölçüm, veri kalitesinde kayıp olmadan test edilmiştir. Optimal ilaç inkübasyon sürelerindeki değişkenlik göz önüne alınmasına rağmen, koşulların ve/veya ilaçların sayısında bilinen bir sınırlama da yoktur.

Giriş

Yeni ilaçların geliştirilmesi, potansiyel ilaçların ve hedeflerinin belirlenmesini, ilaç adaylarının optimize edilmesini ve sentezlenmesini ve klinik öncesi ve klinik çalışmalarda etkinliklerinin ve güvenliklerinin test edilmesini içeren karmaşık ve zaman alıcı bir süreçtir1. İlaç taraması için geleneksel yöntemler, yani terapötik amaçlar için aday bileşiklerin kütüphanelerinin sistematik olarak değerlendirilmesi, belirli hedefler veya yollar üzerindeki etkileri test etmek için hayvan modellerinin veya hücre bazlı tahlillerin kullanılmasını içerir. Bu yöntemler ilaç adaylarının belirlenmesinde başarılı olmakla birlikte, genellikle ilaç etkinliğ....

Protokol

Bu protokol, Bonn Üniversitesi'nin yerel etik kurullarının yönergelerini takip eder.

1. Tamponların, çözeltilerin ve ekipmanların hazırlanması

  1. Çözeltileri hazırlayın ve Malzeme Tablosunda açıklanan malzemeleri toplayın.
  2. Su banyosunu 37 °C'ye ısıtın ve tüm büyüme ortamını ısıtın (RPMI-1640 +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 penisilin / streptomisin).
  3. Hücre hasadı için buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) kullanın.
    NOT: Steriliteyi korumak için hücrelerle çalışırken temiz bir ortam sağlayın.

2. Hücre işleme

Temsili Sonuçlar

Bildirilen protokolü takiben, insan PBMC'leri tohumlandı, farklı immünomodülatör ilaçlarla muamele edildi ve farklı inkübasyon sürelerinden sonra, dizileme protokolü kullanılarak toplu transkriptomik analiz için hasat edildi (Şekil 1).

Test bileşikleri için ideal ilaç konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, tamamlayıcı deneysel stratejiler yardımıyla ve spesifik bilimsel soruya dayalı olarak bu protokolün yukarısında tanımlanmalıdı.......

Tartışmalar

İlaç keşfi ve ilaç geliştirme, toplu transkriptomiklerin sağlayabileceği hücresel süreçlerin bütünsel görünümünden büyük ölçüde yararlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle standart toplu RNA-seq protokolü ile yapılan deneyin yüksek maliyeti ile sınırlıdır ve akademik ortamlarda uygulanmasını ve endüstriyel ölçeklenebilirlik potansiyelini yasaklar.

Protokolün en kritik adımları hücre çözme ve kütüphane hazırlığının ilk adımlarıdır........

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

J.L.S., Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) ve SCHU 950/8-1 kapsamında; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammasyon, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF tarafından finanse edilen mükemmellik projesi Diyet-Vücut-Beyin (DietBB); ve 733100 hibe numarası altında AB projesi SYSCID. M.B., DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352) tarafından desteklenmektedir. L.B., DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Proje numarası 513977171) ve Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) tarafından desteklenmektedir. BioRender.com ile oluşturulan görüntüler.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubefisher scientific10203001
Adhesive PCR Plate SealsThermo Fisher ScientificAB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beadsBeckman CoulterA 63881
Betaine Sigma-Aldrich61962
Cell culture grade 96-well platesThermo Fisher Scientific260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)Integra Bioscience158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM eachFermentasR0192
DMSOSigma-Aldrich276855
DTT (100 mM)Invitrogen18064-014
EDTASigma-Aldrich798681for adherent cells
EthanolSigma-Aldrich51976
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific26140079
Filter tips (10 µL)Gilson F171203
Filter tips (100 µL)Gilson F171403
Filter tips (20 µL)Gilson F171303
Filter tips (200 µL)Gilson F171503
Guanidine HydrochlorideSigma-AldrichG3272
ISPCR primer (10 µM)Biomers.net GmbHSP100065′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)KAPA BiosystemsKK2601
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-AldrichM8266
Magnetic stand 96AmbionAM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primerIllumina
Nuclease-free waterInvitrogen10977049
PBSThermo Fisher ScientificAM9624
PCR 96-well platesThermo Fisher ScientificAB0600
PCR plate sealerThermo Fisher ScientificHSF0031
Penicillin / Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063
Qubit 4 fluorometerInvitrogen15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)TAKARA2313A
RPMI-1640 cell culture medium Gibco61870036If not working with PBMCs, adjust to cell type 
SMART dT30VN primerSigma-Aldrich5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standard lab equipmentvariousvariouse.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)Thermo Fisher Scientific18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)Thermo Fisher Scientific18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200AgilentG2991BA
Thermocycler (S1000)Bio-Rad1852148
TSO-LNA (100 uM)Eurogentec5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 MixerSigma-AldrichZ258415

Referanslar

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.