JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, H-tipi hipertansiyonu indüklemek ve intragastrik olarak uygulanan Huotan Jiedu Tongluo kaynağının (HTJDTLD) antihipertansif etkilerini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. H tipi hipertansiyonu olan sıçanlarda, HTJDTLD, muhtemelen endoplazmik retikulum (ER) strese bağlı apoptoz yolu aktivasyonunun inhibisyonu ile ilişkili etkili antihipertansif etkilere sahipti.

Özet

Yüksek plazma homosistein (Hcy) seviyeleri ile karakterize spesifik bir hipertansiyon formu olan H tipi hipertansiyon, dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir. Bu çalışma, vasküler darlığı tedavi etmek için yaygın olarak kullanılan oldukça etkili bir geleneksel Çin tıbbı formülü olan Huotan Jiedu Tongluo kaynatma (HTJDTLD) nin hipotansif etkilerini ve altta yatan mekanizmaları araştırdı. Sıçanlarda H tipi hipertansiyonu indüklemek için metiyonin kullanıldı ve HTJDTLD intragastrik olarak uygulandı. Daha sonra, sıçanların kaudal arterinin sistolik ve diyastolik kan basınçları noninvaziv sıçan kaudal manometrisi ile ölçüldü. Aortun histolojik değerlendirmesi hematoksilen-eozin (HE) boyaması ile yapıldı. Hcy düzeylerini ölçmek için enzime bağlı immünosorbent assay (ELISA) ve Glukoz düzenleyici protein 78 (GRP78), Tümör nekroz faktörü (TNF) reseptörü ile ilişkili faktör 2 (TRAF2), c-Jun N-terminal kinazlar (JNK) ve kaspaz-3'ün mRNA ve protein düzeylerini belirlemek için kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve western blotlama kullanıldı. Sonuçlar, HTJDTLD'nin metiyonin tedavisinden sonra kan basıncını önemli ölçüde düşürdüğünü, histopatolojik lezyonları hafiflettiğini ve Hcy düzeylerini azalttığını gösterdi. Ayrıca, HTJDTLD, esas olarak endoplazmik retikulum (ER) strese bağlı apoptoz yolunda yer alan GRP78, JNK, TRAF2 ve kaspaz 3'ün gen ve protein ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe etti. Genel olarak, sonuçlar HTJDTLD'nin H tipi hipertansiyonu olan sıçanlarda etkili antihipertansif etkilere sahip olduğunu ve ER stresine bağlı apoptoz yolu aktivasyonunun inhibisyonu ile ilişkili antihipertansif mekanizmaları ortaya çıkardığını göstermiştir.

Giriş

Kalp krizi, felç ve böbrek yetmezliği için önemli bir risk faktörü olan hipertansiyon, dünya çapında 1 milyar insanı etkileyen önemli bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir1. Tiyol grubu içeren bir amino asit olan homosistein (Hcy), metiyonin metabolizmasının hayati bir metabolik aracıdır. Yüksek plazma Hcy düzeyleri ile hipertansiyon, inme gibi kardiyoserebrovasküler hastalıkların ortaya çıkması ve tekrarlaması için önemli bir risk faktörü olabilen H tipi hipertansiyon olarak tanımlanır 2,3. Son yıllarda yapılan çalışmalar, H tipi hipertansiyonun birlikte görülmesinin kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıkların yan etkilerini şiddetlendirebileceğini bildirmiştir4. Özellikle, Çin'de H tipi hipertansiyonu olan hastaların %75'inde primer hipertansiyon vardır ve bu da yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler5. Şu anda, H tipi hipertansiyonun tedavisi esas olarak Batı tıbbını içermektedir. Bununla birlikte, bazı yan etkilere ve zayıf uyuma neden olabilir ve artık H tipi hipertansiyonun kapsamlı yönetimi için ihtiyaçları karşılayamaz.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), Çin'de 2.000 yıldan fazla bir geçmişe sahip eşsiz bir kaynaktır. Batı tıbbında hipertansiyon kontrolüne yönelik karşılanmamış ihtiyaç nedeniyle, klinisyenler TCM'nin H tipi hipertansiyonun önlenmesi ve tedavisinde potansiyel rolünü düşünmeye başlamışlardır6. Huotan Jiedu Tongluo Kaynatma (HTJDTLD), Profesör Yue Deng tarafından formüle edilen ve kapsamlı klinik uzmanlığından yararlanan geleneksel bir Çin tıbbı formülüdür7. 20 yılı aşkın klinik uygulama boyunca, HTJDTLD kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıkların tedavisinde dikkate değer bir etkinlik göstermiştir1. Bununla birlikte, HTJDTLD'nin H tipi hipertansiyonda terapötik etkileri olup olmadığı bildirilmemiştir. Bu nedenle, H-tipi hipertansiyonu olan sıçanlarda HTJDTLD'nin antihipertansif etkilerini ve spesifik mekanizmalarını araştırmayı ve H-tipi hipertansiyonun tedavisi için potansiyel terapötik ilaçları belirlemeyi amaçladık.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Malzemeler, Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvanlar ve tedavi

  1. Toplam 50 yetişkin spontan hipertansif sıçanı (SHR'ler) (erkek, 50 günlük) kontrol (CON), metiyonin (MET), MET + HTJDTLD + Enalapril maleat (EM), MET + EM ve MET + HTJDTLD grupları dahil olmak üzere beş gruba rastgele bölün.
    NOT: Deney fareleri, rahatlıklarını ve esenliklerini sağlamak için tasarlanmış kontrollü bir ortamda barındırıldı. Tesis, sabit 22 °C'ye ayarlanmış ve bağıl nem oranı %40-60 olan sıcaklık kontrollü odalara sahipti. Muhafaza kafesleri şeffaf polikarbonattan yapılmıştır ve her sıçanın serbestçe hareket etmesi için geniş alan sağlar. Aydınlatma programı, doğal gün ışığı koşullarını simüle eden 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünü takip etti. Sıçanlara yeterli yiyecek ve su sağlandı.
  2. Sıçanlara 28 gün boyunca aşağıdaki diyeti sağlayın.
    1. H tipi hipertansiyonu indüklemek için MET grubundaki sıçanlara 28 gün boyunca% 3 metiyonin diyeti verin.
    2. Sıçanlar% 3 metiyonin diyetine ek olarak, sıçanlar 1 mL / kg dozunda HTJDTLD (1.633 g / mL) ve EM (0.2 mg / mL) ile intragastrik olarak MET + HTJDTLD + EM grubunda uygulayın.
    3. MET + EM ve MET + HTJDTLD gruplarındaki sıçanları% 3'lük metiyonin diyetinin yanı sıra gavaj ile sırasıyla HTJDTLD veya EM ile uygulayın.
      NOT: HTJDTLD, Fructus Trichosanthis (20 g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g), Lonicerae japonicae flos (30 g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g), Radix Angelicae sinensis (15 g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g), Hirudo (5 g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g) ve Radix Scrophulariae (15 g) içerir ve daha önce bildirildiği gibi dekaynatılmıştır7. Arıtılmış suda (0.2 mg / mL) çözünen EM, pozitif bir kontrol görevi gördü.

2. Kan basıncı ölçümü

NOT: Kan basıncı ölçümleri noninvaziv bir tansiyon aleti (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. 28 günlük tedaviden sonra, her gruptaki fareleri 12 saat aç bırakın ve kan basıncını ölçün.
  2. Sıçanın boyutuna uygun bir kısıtlama cihazı seçin. Bu çalışmada kullanılan sınırlama cihazı, silindirik bir emniyet ağı, kanvas örtü, termal tüp ve stabilize edici köpük ped içerir. Fareyi emniyet ağına yerleştirin, emniyet ağını termal tüpe yerleştirin ve ardından termal tüpü kanvas kapağına yerleştirin.
  3. Sinyal kablosunu kapağın altında uygun bir konuma yerleştirin. Farenin kuyruğunu kapakta sağlanan boşluğa yerleştirin ve dengeleyici form pedine sabitleyin. Ölçümler için boş, sessiz ve sıcak bir ortam tercih edilir. Sıçanların ölçüm ortamına uyum sağlayabilmesi için sıçanları 20-30 dakika önceden ölçüm alanına taşıyın.
    NOT: Sıçanları stabilize etmek için adım 2.2-2.3 birkaç kez gerçekleştirilebilir. Birkaç eğitim seansından sonra, sıçanlar buna alışacak ve çok hızlı bir şekilde stabilize olabilir, bu da sonraki kan basıncı ölçümü için uygundur.
  4. Basınçlı sensörün hava hortumu bağlantısını, sinyal bağlantısını ve tutma borusunu bağlayın. Basınçlandırma sensörünü kuyruğun ucuna yerleştirin.
  5. Kan basıncını ölçün. Sıçan kuyruğu sensöre yerleştirildikten sonra bir nabız dalgası belirir. Ölçümü başlatmak/durdurmak için Başlat/Durdur'a basın.
    NOT: Cihaz, farenin kuyruğunun sensöre takılıp takılmadığını otomatik olarak belirleyecektir. Farenin kuyruğu yerleştirilmediğinde, basınçlandırma sensörü basınçlandırmaya başlamaz ve ölçümü yapmaz.
  6. Kan basıncı testi tamamlandığında, Sonuç menüsü otomatik olarak açılır. Sonuçlar menüsünde ölçümün ortalama değerini, standart sapmayı (SD), standart hatayı (SE) ve varyasyon katsayısını (CV) kontrol edin.
    NOT: Her sıçanın kan basıncı, 2 dakikadan fazla aralıklarla üç kez ölçüldü ve ortalama değer hesaplandı.
  7. Kan basıncını ölçtükten sonra, fazla% 2 sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçanı ötenazi yapın. Daha sonra, cerrahi makas ve dişli forseps kullanarak, fareyi perineden boyuna kadar katman katman inceleyin. Göğüs ve karın içeriğini ters çevirin, iki böbrek arasındaki abdominal aort bifurkasyonuna gidin ve aortu aort kemerinin bir bölümüne kadar toplayın.

3. Hematoksilen-eozin (HE) boyaması

  1. Aort vasküler dokusunu en az 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
  2. Vasküler örnekleri alın, gradyan alkolde kurutun, ksilen içinde şeffaf hale getirin ve parafine gömün.
  3. Gömdükten sonra 3-5 mm kalınlığında sürekli dilimler yapın. Dilimleri 60-70 °C'de kurutun, ardından oda sıcaklığında (RT) saklayın.
  4. Bölümleri ksilen I'e 30 dakika, ksilen II'ye 30 dakika, %100 alkol I'e 10 dakika, %100 alkol II'ye 10 dakika, %95 alkol I'e 5 dakika, %95 alkol II'ye 5 dakika, %80 alkole 5 dakika daldırarak bölümleri mumdan arındırın ve ardından damıtılmış su ile durulayın.
  5. Bölümleri Harris hematoksilen içinde 5 dakika boyayın ve musluk suyunda 5 dakika durulayın. 10 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit alkolü ayırt edin ve musluk suyunda 15 dakika boyunca iyice durulayın. Bölümü amonyaklı suda 5 saniye yıkayın ve musluk suyunda 15 dakika boyunca iyice durulayın.
  6. Mikroskobik gözlem yapın, 10 dakika boyunca eozin kullanarak boyayın ve 15 dakika boyunca musluk suyunda iyice durulayın.
  7. Bölümleri 10 saniye boyunca %80 etil alkole, 5 dakika boyunca %95 alkol I'e, 5 dakika boyunca %95 alkol II'ye, 10 dakika boyunca %100 alkol I'e, 10 dakika boyunca %100 alkol II'ye, 10 dakika boyunca ksilen I'e ve 10 dakika boyunca ksilen II'ye batırarak kurutun.
  8. Bölümleri nötr sakız kullanarak kapatın.
  9. Işık mikroskobu altında aort dokularındaki histolojik değişiklikleri gözlemleyin (100x objektif, 1000x büyütme).

4. Masson'un trikrom boyaması

  1. HE boyamaya benzer şekilde rutin mum alma işlemi yapın.
  2. Hematoksilen boyama: Slaytları 10 dakika hematoksilen çözeltisine daldırın, ardından hemen musluk suyuyla durulayın.
  3. Slaytları birkaç saniye %1 hidroklorik asit çözeltisine daldırın, ardından hemen ardından musluk suyuyla durulayın.
  4. Slaytları 5 dakika boyunca Lichtenstein asidik macenta lekesine batırın ve ardından suyla durulayın.
  5. Slaytları 5 dakika boyunca %1 fosfomolibdik aside daldırın.
  6. Slaytları 5 dakika boyunca %2 anilin mavisi boyamaya ve 1 dakika boyunca %1 buzlu asetik asit daldırma yıkama solüsyonuna daldırın. Daha sonra slaytları 3 kez% 95 alkolle hızlı bir şekilde yıkayın.
  7. HE boyamaya benzer şekilde rutin dehidrasyon, şeffaflık ve nötr diş eti sızdırmazlığı gerçekleştirin.

5. ELISA ile Hcy ölçümü

  1. Sıçanları% 2 pentobarbital sodyum (45 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve anestezi derinliğini bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın. Fareyi tutun ve kan alırken teması önlemek için bıyıklarını kesin. Sıçanın gözbebeklerini kavisli forseps ile çıkarın ve kanı hazırlanan steril mikrosantrifüj tüplerinde toplayın. Daha sonra, sıçanı fazla% 2 sodyum pentobarbital (100 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapın.
  2. Kanın RT'de 10-20 dakika boyunca doğal olarak pıhtılaşmasına izin verin ve ardından kanı 2-8 ° C'de yaklaşık 20 dakika santrifüjleyin (626-1409 x g).
  3. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve -80 °C'de buzdolabında saklayın.
  4. Test tüpündeki standardı kit talimatlarına göre seyreltin.
  5. Boş kuyucuklar (boş kontrol kuyucuklarına hiçbir numune ve enzim reaktifi eklenmez; adımların geri kalanı aynıdır), standart kuyucuklar ve test edilecek numune kuyucukları oluşturun. Plakaya 50 μL standart, numune kuyucuklarına 40 μL numune seyreltme çözeltisi ve ardından 10 μL serum ekleyin (numunenin son seyreltilmesi 5 kattır).
    NOT: Numuneyi plakanın kuyucuklarının dibine ekleyin; Kuyuların duvarlarına dokunmamaya çalışın ve karıştırmak için hafifçe sallayın.
  6. Plakayı sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  7. 30 kez konsantre yıkama solüsyonunu 30 kez damıtılmış su ile seyreltin ve kullanıma hazırlayın.
  8. Sızdırmazlık filmini dikkatlice çıkarın, sıvıyı atın ve tüm sıvıyı çıkarmak için sallayın. Her kuyuyu yıkama solüsyonuyla doldurun, 30 saniye bekletin ve atın. Bunu 5 kez tekrarlayın ve kurulayın.
  9. Boş kuyucuklar hariç her oyuğa 50 μL enzim reaktifi ekleyin.
  10. Plakayı kapatmak için bir sızdırmazlık filmi kullanın ve ardından 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  11. Adım 5.8'i tekrarlayın.
  12. Her oyuğa 50 μL renk geliştirici A ekleyin, ardından 50 μL renk geliştirici B ekleyin ve iyice karıştırmak için hafifçe çalkalayın. Düşük ışık altında 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
  13. Reaksiyonu sonlandırmak için her bir oyuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin (mavi renk sarıya dönecektir).
  14. Boş kuyucuklarla reaksiyonu sıfırlayın ve her bir kuyucuğun absorbansını (OD değeri) sırayla 450 nm'de ölçün.
    NOT: Ölçüm, durdurma çözeltisinin eklenmesinden sonraki 15 dakika içinde yapılmalıdır.

6. RNA ekstraksiyonu ve kantitatif RT-PCR

  1. Toplam RNA'yı çıkarın.
    1. Taze aort dokusunu hızlı bir şekilde uygun boyuta (30-50 mg / adet) kesin ve sıvı nitrojen içinde iyice öğütün. 1 mL Trizol reaktifi ekleyin, iyice karıştırın ve dokuyu parçalamak için buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
    2. 2250 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı pelet olmadan yeni bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
    3. 200 μL kloroform ekleyin, 15 saniye kuvvetlice çalkalayın ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
    4. 2250 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Karışım üç katmana ayrılacaktır: alt fenol-kloroform organik faz, orta faz ve üst sulu faz.
    5. Üst sulu fazı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne (yaklaşık% 60 Trizol hacmi) aktarın. Ara fazı aspire etmeyin; Az miktarda üst sıvı bırakılabilir.
    6. Eşit hacimde izopropanol ekleyin, yaklaşık 10 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın ve RT'de 10 dakika bekletin.
    7. 2250 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve RNA çökeltisini 1 mL% 75 etanol ile iki kez yıkayın.
    8. 2250 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve RT'de 5-10 dakika havayla kurutun.
    9. RNA'yı 15-50 μL dietilpirokarbonat (DEPC) suda çözün ve RNA konsantrasyonunu kontrol edin.
  2. Ters transkripsiyon ve RT-qPCR gerçekleştirin (Tablo 1)
    1. qRT-PCR ile endoplazmik retikulum stresi (ERS) ve apoptoz ile ilgili gen ekspresyonunu tespit edin. Adım 6.1'de ekstrakte edilen toplam RNA'yı kullanın ve üreticinin talimatlarına göre cDNA sentez kitini kullanarak cDNA'ya ters çevirin.
    2. 20 μL'lik bir reaksiyon hacminde bir SYBR Green PCR ana karışımı ile gerçek zamanlı bir PCR tespit sistemi kullanarak gen ekspresyonunu belirleyin.
    3. Verileri 2−ΔΔCTyöntemiyle kantitatif olarak analiz edin ve bunu β-aktin ifadesine göre n kat fark olarak ifade edin. Primerler Tablo 2'de gösterilmiştir.

7. Batı lekeleme (WB)

  1. Toplam doku proteinini çıkarın.
    1. 1-2 mL homojenizatörün küresel kısmına az miktarda doku bloğu yerleştirin ve doku bloğunu temiz bir makasla mümkün olduğunca kesin.
    2. 400 μL (w:v=1:10) RIPA lizis tamponu ekleyin ve homojenize edin. Ardından buzun üzerine yerleştirin. Birkaç dakika sonra tekrar öğütün ve buzun üzerine yerleştirin. Öğütme işlemini birkaç kez tekrarlayın.
    3. 30 dakikalık lizizden sonra, lizatı 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın ve tüpü önceden soğutulmuş 4 ° C'lik bir santrifüje yerleştirin. 10 dakika boyunca 2250 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  2. Proteini ölçün.
    1. Protein standartlarını kitin talimatlarına göre seyreltin. Aşağıdaki gibi standart gradyanlarını elde edin: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 ve 2000 ng/μL.
    2. Protein örneğinden 2,5 μL alın ve örnek seyrelticiyi kullanarak 25 μL'ye (10 kat) seyreltin.
    3. 96 oyuklu bir plaka alın ve 20 μL standart protein numunesi (konsantrasyon gradyanına göre) ve hedef proteini, her hedef protein numunesi için sırasıyla iki kuyucuk olmak üzere kuyucuklara ekleyin.
    4. Sıvı A ve sıvı B'yi 50:1 oranında karıştırarak gelişen çözeltiyi (kullanıma hazır) hazırlayın ve her bir kuyucuğa 200 μL geliştirici çözelti ekleyin.
    5. Eklenen numunelerle birlikte 96 oyuklu plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
    6. Absorbansı 562 nm'de tespit edin.
    7. Ölçülecek protein konsantrasyonunu hesaplayın.
      1. Standart eğriyi çizmek için standart protein konsantrasyonunu dikey koordinat olarak ve 562 nm'deki absorbansı yatay koordinat olarak alın.
      2. Standart eğriden elde edilen formüle ve hedef proteinin ölçülen emilimine dayalı olarak hedef proteinin konsantrasyonunu hesaplayın.
    8. Bir mikrosantrifüj tüpünde 20 μL protein örneğine 180 μL yükleme tamponu ekleyin. Santrifüj tüpünü metal bir banyoya yerleştirin ve 100 °C'de 10 dakika denatüre edin. Denatüre protein WB'yi kullanın veya -20 °C'de saklayın.
  3. İmmünoblotlama gerçekleştirin.
    1. Protein elektroforez jelini yapılandırın.
      1. Jel döküm cam plakayı (1 mm veya 1,5 mm) temizleyin ve kurutun ve jel döküm cihazına sabitleyin.
      2. Tablo 3'e göre% 10 ayırma jeli hazırlayın. Yapılandırılmış ayırma jelini cam plakalar arasına ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için jel çözeltisini yavaşça ekleyin. Ardından, ayırıcının sıvı yüzeyini düzleştirmek için uygun miktarda susuz etanol ekleyin. Jel katılaşana kadar 20-30 dakika RT'de bırakın.
        NOT: Moleküler ağırlık ne kadar yüksek olursa, diğer ayırıcı tutkal konsantrasyonlarını formüle etme ihtiyacına bağlı olarak tutkal konsantrasyonu o kadar düşük olur.
      3. Tablo 3'e göre% 5 konsantre jel hazırlayın. Ayırma jelinin katılaşmasından sonra, susuz etanolün üst tabakasını dökün, konsantre jeli doldurun ve cam plakaya uyan jel tarağını yavaşça yerleştirin (hava kabarcıkları olmamasına dikkat edin). Konsantre jelin katılaşması için 20-30 dakika RT'de bırakın.
    2. Elektroforez gerçekleştirin.
      1. 60.5 g Tris, 375 g glisin ve 20 g sodyum dodesil sülfat (SDS) ağırlığında. 2 L'ye su ekleyin, 60 °C'de ısıtın ve 10x elektroforez çözeltisi oluşturmak için çözünmesi için karıştırın. Çözüm RT'de olsun; Kullanıldığında 1x'e kadar seyreltin.
      2. Yapıştırıcı içeren cam plakayı jel döküm cihazından çıkarın, su akışındaki tutkal tarağını düzgün bir hızda aşağı çekin ve aynı zamanda numune alma deliğindeki hava kabarcıklarını boşaltın.
      3. Cam plakayı elektroforez tankına sabitleyin ve yapılandırılmış 1x elektroforez çözeltisini ekleyin. İç tankın dolu olduğundan ve dış tankın iç tankın yarısı olduğundan emin olun.
      4. Numune ekleme kuyucuğuna aynı kütlede protein numunesi ve 5 μL işaretleyici (proteinin boyutunu belirtmek için kullanılır) ekleyin.
      5. Jeli 60 V'ta 20 dakika, ardından yükleme tamponu dibe inene kadar 90 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
    3. Membran transferi gerçekleştirin.
      1. 60 g Tris ve 288 g glisin tartın ve 2 L'ye su ekleyin. 10x membran transfer çözeltisi yapmak için çözeltiyi iyice karıştırın ve çözün ve RT'de rezerve edin. 1x çalışma çözeltisi yapmak için 1: 2: 7 oranında seyreltin (10x transmembran çözeltisi: metanol: su).
        NOT: Transmembran çözeltisi önceden hazırlanmalı ve buzdolabında 4 ° C'ye soğutulmalıdır.
      2. Membran üzerindeki pozitif yüklü grupları aktive etmek ve negatif yüklü proteinlerle bağlanmayı kolaylaştırmak için PVDF'yi uygun bir süre (0,5-1 dakika) metanol içinde bekletin.
      3. Membran transfer klipsini alın ve bileşenleri sırayla yerleştirdikten sonra sabitleyin (siyah yüzey-sünger-filtre kağıdı-elektroforez jeli-PVDF membran-filtre kağıdı-sünger-beyaz yüzey sırayla).
        NOT: Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olun; Hava kabarcıkları olduğunda, hava kabarcıklarını çıkarmak için silindiri kullanın.
      4. Ateli membran transfer tankına yerleştirin, doğru elektrot yerleşimine dikkat edin, tanka iki buz torbası koyun ve 1x membran transfer sıvısı ile doldurun. Son olarak, tüm transmembran tankını buza yerleştirin.
      5. Membran transfer koşullarını 1 saat boyunca 100 V'a ayarlayın.
        NOT: Membran transfer süresi proteinin boyutuna göre ayarlanabilir; Proteinin moleküler ağırlığı ne kadar küçükse, zar transfer süresi o kadar kısa olur.
    4. Engelleme gerçekleştirin.
      1. Fosforile proteinler için, bloke edici çözelti olarak% 5 BSA (çözücü TBST) kullanın. Fosforile olmayan proteinler için, bloke etmek için% 5 yağsız süt (çözücü TBST) kullanın.
      2. Engelleme çözeltisini uygun büyüklükte bir tabağa dökün. PVDF membranını tabağa koyun ve PVDF membranının engelleme solüsyonuna batırıldığından emin olun. Çanağı kapatın ve RT'de 1 saat inkübe edin.
      3. Membranı çıkarın. İşaretleyici ekranına ve her bir hedef proteinin boyutuna göre, zarı uygun boyutta kesin ve seri numaralarıyla etiketleyin.
    5. Antikoru inkübe edin
      1. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve kalan sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin. Karşılık gelen kesilmiş PVDF'yi karşılık gelen antikor dilüsyonlarına (CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], kaspaz [1:1000] ve GAPDH [1:1000] dahil) yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de döner çalkalayıcıya yerleştirin.
      2. 1x TBST ekleyin ve RT'de üç kez durulayın (her biri 10 dakika).
      3. PVDF membranını, üreticinin talimatlarına göre ikincil antikor dilüsyonlarında inkübe edin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
      4. RT'ye üç kez (her biri 10 dakika) 1x TBST ekleyerek membranı durulayın.
    6. PVDF membranını geliştirin.
      1. Lüminesan çözelti kitinde eşit hacimlerde sıvı A ve sıvı B'yi karıştırın, iyice çalkalayın ve kullanıma hazırlayın.
      2. PVDF membranını yaymak için streç filmin üzerine yerleştirin ve hazırlanan ışıldayan maddeyi membranın üzerine hızlı ve eşit bir şekilde hızlı ve eşit bir şekilde ekleyin. Işıktan kaçınarak RT'de 3 dakika inkübe edin.
      3. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) western blotting tespit reaktiflerini kullanarak protein bantlarını tespit edin.

8. Veri analizi

  1. Tüm verileri ortalama ± S.D olarak ifade edin. SPSS 20.0 yazılımını kullanarak tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analiz yapın. p < 0.05 olduğunda farklılıkları istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Sonuçlar

Tablo 4 ve Tablo 5'te gösterildiği gibi, sistolik kan basıncı (SBP) ve diyastolik kan basıncı (DBP), MET grubunda 1 ila 4 hafta arasında CON grubundakilere göre anlamlı derecede yüksekti. HTJDTLD tedavisinden sonra, sıçanların SBP ve DBP'si MET grubundakilerden anlamlı derecede düşüktü. Özellikle, HTJDTLD ve EM'nin kombine kullanımı, tek başına HTJDTLD tedavisinden daha güçlü bir antihipertansif etkiye sahipti.

HE boyaması ve Masson'...

Tartışmalar

Hipertansiyon, yetişkin nüfusun üçte birini etkileyen ve inme, koroner kalp hastalığı ve kalp ve böbrek yetmezliği riskini artıran en yaygın kardiyovasküler bozukluklardanbiridir8. H tipi hipertansiyon, primer hipertansiyon ve artmış homosistein düzeylerinin birlikte ortaya çıkması ile ifade eden ve yıllar içinde geniş ilgi gören özel bir hipertansiyon türüdür9. Son yıllarda, oral EM'nin antihipertansif ilaçlarla birlikte kullanımı, kan basınc...

Açıklamalar

Araştırmanın, potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederiz.

Teşekkürler

Bu çalışma, Jilin Eyaleti Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (no. YDZJ202301ZYTS189).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

Referanslar

  1. Noone, C., Dwyer, C. P., Murphy, J., Newell, J., Molloy, G. J. Comparative effectiveness of physical activity interventions and antihypertensive pharmacological interventions in reducing blood pressure in people with hypertension: Protocol for a systematic review and network meta-analysis. Syst Rev. 7 (1), 128 (2018).
  2. Huang, K., Zhang, Z., Huang, S., Jia, Y., Zhang, M., Yun, W. The association between retinal vessel abnormalities and h-type hypertension. BMC Neurol. 21 (1), 6 (2021).
  3. Tan, Y., Nie, F., Wu, G., Guo, F., Wang, Y., Wang, L. Impact of h-type hypertension on intraplaque neovascularization assessed by contrast-enhanced ultrasound. J Atheroscler Thromb. 29 (4), 492-501 (2022).
  4. Towfighi, A., Markovic, D., Ovbiagele, B. Pronounced association of elevated serum homocysteine with stroke in subgroups of individuals: A nationwide study. J Neurol Sci. 298 (1-2), 153-157 (2010).
  5. Zhong, C., et al. High homocysteine and blood pressure related to poor outcome of acute ischemia stroke in Chinese population. Plos One. 9 (9), e107498 (2014).
  6. Hao, P., Jiang, F., Cheng, J., Ma, L., Zhang, Y., Zhao, Y. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: Evidence and potential mechanisms. J Am Coll Cardiol. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  7. Tian, T., et al. Huotan Jiedu Tongluo decoction inhibits balloon-injury-induced carotid artery intimal hyperplasia in the rat through the perk-eif2α-atf4 pathway and autophagy mediation. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536237 (2021).
  8. Simko, F., Pechanova, O. Potential roles of melatonin and chronotherapy among the new trends in hypertension treatment. J Pineal Res. 47 (2), 127-133 (2009).
  9. Li, T., et al. H-type hypertension is a risk factor for cerebral small-vessel disease. BioMed Res Int. 2020, 6498903 (2020).
  10. Rodrigo, R., Passalacqua, W., Araya, J., Orellana, M., Rivera, G. Homocysteine and essential hypertension. J Clin Pharmacol. 43 (12), 1299-1306 (2003).
  11. Lehmann, M., Gottfries, C. G., Regland, B. Identification of cognitive impairment in the elderly: Homocysteine is an early marker. Dement Geriatr Cogn. 10 (1), 12-20 (1999).
  12. dos Santos, E. F., et al. Evidence that folic acid deficiency is a major determinant of hyperhomocysteinemia in Parkinson's disease. Metab Brain Dis. 24 (2), 257-269 (2009).
  13. Zhao, W., Gao, F., Lv, L., Chen, X. The interaction of hypertension and homocysteine increases the risk of mortality among middle-aged and older population in the United States. J Hypertens. 40 (2), 254-263 (2022).
  14. Woo, K. S., et al. Hyperhomocyst(e)inemia is a risk factor for arterial endothelial dysfunction in humans. Circulation. 96 (8), 2542-2544 (1997).
  15. Lu, F., et al. The intervention of enalapril maleate and folic acid tablet on the expressions of the grp78 and chop and vascular remodeling in the vascular smooth muscle cells of h-hypertensive rats with homocysteine. Eur Rev Med Pharmaco. 22 (7), 2160-2168 (2018).
  16. López-García, P., Moreira, D. Selective forces for the origin of the eukaryotic nucleus. BioEssays. 28 (5), 525-533 (2006).
  17. Minamino, T., Komuro, I., Kitakaze, M. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutic target in cardiovascular disease. Circ Res. 107 (9), 1071-1082 (2010).
  18. Chen, X., Cubillos-Ruiz, J. R. Endoplasmic reticulum stress signals in the tumour and its microenvironment. Nat Rev Cancer. 21 (2), 71-88 (2021).
  19. Ji, C., Kaplowitz, N. Hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticulum stress, and alcoholic liver injury. World J Gastroentero. 10 (12), 1699-1708 (2004).
  20. Zhang, C., et al. Homocysteine induces programmed cell death in human vascular endothelial cells through activation of the unfolded protein response. J Biol Chem. 276 (38), 35867-35874 (2001).
  21. Cunard, R. Endoplasmic reticulum stress, a driver or an innocent bystander in endothelial dysfunction associated with hypertension. Cur Hypertens Rep. 19 (8), 64 (2017).
  22. Casas, C. GRP78 at the centre of the stage in cancer and neuroprotection. Front Neurosci. 11, 177 (2017).
  23. Urano, F., et al. Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase ire1. Science. 287 (5453), 664-666 (2000).
  24. Borghi, A., Verstrepen, L., Beyaert, R. TRAF2 multitasking in tnf receptor-induced signaling to nf-κb, map kinases and cell death. Biochem Pharmacol. 116, 1-10 (2016).
  25. Wen, X. -. R., et al. Butylphthalide suppresses neuronal cells apoptosis and inhibits JNK-caspase3 signaling pathway after brain ischemia /reperfusion in rats. Cell Mol Neurobiol. 36 (7), 1087-1095 (2016).
  26. Jin, M., et al. Serine-threonine protein kinase activation may be an effective target for reducing neuronal apoptosis after spinal cord injury. Neural Regen Res. 10 (11), 1830-1835 (2015).
  27. Xu, F., et al. Estrogen and propofol combination therapy inhibits endoplasmic reticulum stress and remarkably attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury and ogd injury in hippocampus. Biomed Pharmacother. 108, 1596-1606 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler H tipi HipertansiyonHuotan Jiedu Tongluo KaynatmaKan Bas ncHomosisteinEndoplazmik Retikulum StresiApoptoz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır