Ex Vivo Hastadan Elde Edilen Glioma Organoidlerinin Bir Doku Kıyıcı Kullanılarak Yetiştirilmesi

Özet

Bu çalışma, bir doku kıyıcı kullanarak hasta kaynaklı glioblastoma 3 boyutlu organoidler oluşturmak için otomatik bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, terapötik testler için bu tür organoidleri elde etmek için uygun ve etkili bir yaklaşım sağlar.

Özet

Glioblastom, IDH-vahşi tip, CNS WHO grade 4 (GBM), agresif tedaviye rağmen kötü hasta sağkalımı ile ilişkili primer bir beyin tümörüdür. Gerçekçi ex vivo modeller geliştirmek zor olmaya devam ediyor. Hasta kaynaklı 3 boyutlu organoid (PDO) modeller, orijinal tümörlerin temel özelliklerini korurken GBM'nin fenotipik ve moleküler heterojenliğini yakalayan yenilikçi platformlar sunar. Bununla birlikte, PDO üretimi için manuel diseksiyon zaman alıcıdır, pahalıdır ve bir dizi düzensiz ve eşit olmayan boyutta PDO'ya neden olabilir. Bu çalışma, otomatik bir doku kıyıcı kullanarak PDO üretimi için yenilikçi bir yöntem sunmaktadır. Dört GBM ve bir astrositom, IDH-mutant, CNS WHO grade 2 hastalarından alınan tümör örnekleri, doku kıyıcı kullanılarak manuel olarak işlendi. Manuel yaklaşımda, tümör materyali mikroskobik kontrol altında neşter kullanılarak diseke edilirken, doku kıyıcı üç farklı açıda kullanıldı. 37 °C'de orbital çalkalayıcı üzerinde kültürü takiben, morfolojik değişiklikler parlak alan mikroskobu kullanılarak değerlendirilirken, proliferasyon (Ki67) ve apoptoz (CC3) 6 hafta sonra immünofloresan ile değerlendirildi. Doku kıyıcı yöntemi, üretim süresinin neredeyse %70'ini azalttı ve ikinci haftadan itibaren elle işlenen dokuya kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir PDO ortalama sayısı ile sonuçlandı (2. hafta: 801'e karşı 601, P = 0.018; 3. hafta: 1105'e karşı 771, P = 0.032; ve 4. hafta: 1195'e karşı 784, P < 0.01). Kalite değerlendirmesi, her iki üretim yöntemi için de benzer tümör hücresi apoptozu ve proliferasyon oranlarını ortaya koydu. Bu nedenle, otomatik doku kıyıcı yöntemi, zaman ve PDO verimi açısından daha verimli bir yaklaşım sunar. Bu yöntem, GBM hastalarının ilaç veya immünoterapi taraması için umut vaat etmektedir.

Giriş

Düşük dereceli gliomlar (LGG'ler), glioblastoma gibi yüksek dereceli gliomlara kıyasla tipik olarak yavaş büyüyen ve daha az agresif olarak ortaya çıkan, nispeten nadir görülen bir beyin tümörü grubudur. Hem yetişkinlerde hem de çocuklarda ortaya çıkabilirler, yetişkinlerde biraz daha yüksek bir prevalansa sahiptirler. Kesin prevalans bölgeye ve popülasyona göre değişir, ancak LGG'ler tüm primer beyin tümörlerinin yaklaşık %15-20'sini oluşturur¹. LGG'ler için tedavi stratejileri genellikle nörolojik fonksiyonu korurken tümör rezeksiyonunu en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan cerrahi, radyasyon tedavisi ve kemoterapinin bir kombinasyonunu içerir. LGG'lerin yönetimi karmaşık olabilir ve tedavi seçimi tümörün yeri ve moleküler özellikleri gibi faktörlere bağlı olabilir². LGG'lerin genetik ve moleküler temellerinin anlaşılmasındaki ilerlemeler, daha hedefe yönelik tedavilere yol açmıştır ve devam eden araştırmalar, tedavi yaklaşımlarını iyileştirmeye devam etmektedir.

Glioblastoma, IDH-vahşi tip, CNS WHO grade 4 (GBM) ise 100.000 kişi-yıl başına 3.19-4.17 vaka arasında insidans oranı ile erişkinlerde bulunan en yaygın primer beyin tümörüdür³. GBM, baş ağrısı, nöbetler, fokal nörolojik defisitler, kişilik değişiklikleri ve kafa içi basınç artışı gibi semptomlara neden olur. GBM için standart tedavi, mümkünse tümörün şişirilmesini ve ardından Temozolomid⁴ ile kombine radyasyon tedavisini içerir. Ayrıca, Temozolomid ve Lomustin'in birleştirilmesi, O6-metilguanin-metiltransferaz (MGMT)-promotör metilasyonu 5 olan hastalarda medyan genel sağkalım oranını artırabilir. Bununla birlikte, bu son terapötik yaklaşımlara rağmen, GBM, Tümör Tedavi Alanları (TTFields) eklendiğinde hastaların medyan genel sağkalım oranının 16 aydan 20.9 aya kadar olması ile karakterize edilen, kötü prognozlu tedavi edilemez bir hastalık olmaya devam etmektedir ^3,6. GBM'de çeşitli immünoterapötik yaklaşımlar araştırılmıştır, ancak in vivo sınırlı etkinlik göstermiştir. Ayrıca, klinik ve klinik öncesi sınırlamalar terapötik atılımları engellemektedir⁷. Uygun ve gerçekçi bir ex vivo modelin oluşturulması, GBM'nin ^inter-8 ve intratumoral⁹ heterojenliği nedeniyle zor olmuştur.

Konvansiyonel 2 boyutlu (2D) hasta hücre hatları, homojen hücre popülasyonlarını temsil eder ve yüksek verimli ilaç taraması için uygundur. Bununla birlikte, hasta kaynaklı ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, büyüme koşullarındaki farklılıklar ve çoklu geçişlerden sonra genotipik ve fenotipik özelliklerdeki sapmalar nedeniyle GBM'yi yeterince taklit edemez 10,11,12.

Öte yandan, 3D organoid modeller son zamanlarda organ ve çeşitli kanser türlerinin fenotipik ve moleküler heterojenliğini kopyalayan umut verici sistemler olarak ortaya çıkmıştır 13,14,15,16,17,18. GBM bağlamında, serebral organoidler, tümör benzeri özellikleri ^16,17 simüle etmek için genetik olarak modifiye edilmiştir veya tümör hücresi infiltrasyonunu^indüklemek için GSC'ler veya sferoidlerle birlikte kültürlenmiştir^18,19. Matrigel ve EGF/bFGF ile kültürlenen hasta kaynaklı GBM organoidleri, kök hücre heterojenliği ve hipoksi²⁰ gibi GBM ayırt edici özellikleri sergilerken, bu modelin hastaların neoplazmlarının temel moleküler özelliklerini ne ölçüde temsil edebileceği belirsizliğini korumaktadır.

Hasta kaynaklı GBM organoidleri (PDO'lar), histolojik özellikler, hücresel çeşitlilik, gen ekspresyonu ve mutasyon profilleri dahil olmak üzere benzer ebeveyn tümörlerinin baskın özelliklerini koruyabilen umut verici modellerdir. Ek olarak, yetişkin kemirgen beyinlerine implantasyon üzerine hızla sızarlar ve uyuşturucu testi ve kişiselleştirilmiş tedavi için gerçekçi bir model sağlarlar²¹. Bununla birlikte, PDO'ları oluşturmak için tümör dokusunu manuel olarak incelemek zaman alıcı ve maliyetlidir. Bu nedenle, bireyselleştirilmiş ilaç testi için umut vaat eden farklı terapötik yaklaşımların kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan, çok sayıda PDO üretebilen hızlı bir yönteme acil ihtiyaç vardır. Bu çalışma, otomatik bir doku kıyıcı kullanılarak doğrudan yeni diseke edilmiş tümör dokusundan PDO'ların üretilmesi için yeni bir yöntemi tanımlamaktadır. Ayrıca, bu yöntemle üretilen PDO'lar, PDO sayısı, morfolojik özellikler, apoptoz ve tümör hücrelerinin proliferasyonu açısından aynı hastalardan manuel olarak diseke edilen PDO'larla karşılaştırıldı.

Protokol

Tüm hastalar, Helsinki bildirgesine uygun olarak ve Würzburg Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (#22/20-me) tarafından onaylanan yazılı bilgilendirilmiş onam verildikten sonra Almanya'daki Würzburg Üniversite Hastanesi Nöroşirürji Bölümü'nde tedavi edildi. Dört GBM hastası ve bir astrositom, IDH-mutant, CNS WHO grade 2 hastasından (düşük dereceli gliom, LGG) tümör doku materyali (Tablo 1) cerrahiden elde edildi ve aşağıdaki protokol kullanılarak işlendi. Bir doku kıyıcı kullanarak PDO'ların otomatik olarak üretilmesi işlemi, kıyıcı (C) olarak adlandırılır ve dokuyu mikroskobik kontrol altında iki neşter ile manuel olarak kesme işlemi manuel (M) olarak adlandırılır. Tümör örneğinden eşit büyüklükte altı kesit (1-2^cm3) diseke edildi, daha sonra her biri ikiye bölündü ve iki yöntem kullanılarak homojen bir şekilde işlendi. Yukarıda bahsedilen intratümöral heterojenlik nedeniyle, her hastadan her yaklaşım için bir 6 oyuklu plaka üretildi ve her kuyucuk orijinal tümör içinde farklı bir bölgeden PDO'ları temsil etti. Her iki prosedür de laminer bir hava akımı kabini altında gerçekleştirildi ve kullanılan tüm aletler kullanımdan önce sterilize edildi. Yaklaşıma genel bakış Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. Agaroz bloklarının hazırlanması (sadece C-yaklaşımı için, isteğe bağlı)

1. Bir behere 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) doldurun, bir tablet agaroz ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve süspanse olana kadar iyice karıştırın.
2. Karışımı mikrodalgada 30-40 saniye ısıtın, kaynatmaktan kaçının. Ardından karışımı 47 °C'ye ulaşana kadar soğutun.
3. Agaroz karışımını kapalı silindir şeklindeki bir döküm kalıbına dökün ve herhangi bir kabarcık oluşumunu önleyin. Kalıbı donmuş (-20 °C) bir kelepçe kullanarak veya 30 dakika boyunca kuru buz üzerine koyarak hemen soğutun.

2. Tümör materyalinin işlenmesi

1. Ameliyathaneden laboratuvara giderken tümör materyalini soğutmak için bir kutu buz hazırlayın.
2. Tümör dokusunu (4-5 cm³), tümörü kaplayan 25 mL Hibernate A içeren steril 50 mL'lik bir tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu) ve tüpü buz kutusuna yerleştirin.
3. Laminer bir hava akımı kabini altında, tümör materyalini Hibernate A ile birlikte sterilize edilmiş bir cam Petri kabına aktarın.
4. Nekrotik dokuyu ortadan kaldırın ve mikroskobik kontrol altında bir neşter ve doku forseps kullanarak kan damarlarını dikkatlice inceleyin. Nekrotik dokuyu, kanamadan kaynaklanan kahverengimsi bir renk tonu sergileyen hemorajik alanlarla veya bitişik canlı dokuya göre daha soluk veya daha beyaz bir görünüm sergileyen dokularla tanımlayın. Dokuyu sıkmamaya veya bozmamaya dikkat edin.
5. Tümör materyalini yaklaşık 1-2^cm3 büyüklüğünde altı parçaya kesin. Parçaları, her biri²² olan 3 mL H-GPSA ortamı (Tablo 2) ile önceden doldurulmuş plastik Petri kaplarına (n = 6) dağıtın. Petri kaplarını buzun üzerine yerleştirin.

3. Doku kıyıcının ayarlanması

1. Bıçağı üretici kılavuzunda²³ açıklandığı gibi konumlandırın.
2. Dilim kalınlığını 0,45-0,50 mm'ye ayarlayın. Bıçak kuvvetini orta seviyeye ayarlayın. Masa serbest bırakma düğmesini "başlat" moduna sabitleyin.

4. Tümör dokusu parçalarının işlenmesi

1. Tümör dokusunun kıyıcı ile işlenmesi (C yöntemi)
   1. Agaroz bloklarını 2 cm uzunluğunda silindirler halinde kesin ve bu silindirlerden birini histoakril yapıştırıcı kullanarak doğrayıcı dairesel plastik tabağa yapıştırın (bkz.
   2. Bir neşter kullanarak agaroz silindirinde bir derinleşme oluşturun ve ardından tümör dokusunu ilk kuyudan (adım 2.5) bu çukura yerleştirin.
      NOT: Tümör materyali dikkatli bir şekilde kullanılmalı ve boşluğa sıkıştırılmamalı veya itilmemelidir. Boşluk, tümöre kolayca sığacak kadar büyük, ancak kesme işlemi sırasında tümör materyalini sabit tutacak kadar küçük olmalıdır. Adımlar 4.1.1. ve 4.1.2. isteğe bağlıdır.
   3. Plastik diski kesim tablasının montaj diskine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
   4. Doğrayıcıyı çalıştırın ve sıfırlama düğmesine basın. Doğrayıcı şimdi kesmeye başlar (ilk tur). Masa sona ulaştıktan sonra makine otomatik olarak durur ve hem agaroz hem de tümör dokusu istenilen çapta kesilir.
   5. Montaj diskini 90° döndürün ve ardından serbest bırakma tablası düğmesini başlangıç moduna ayarlayın.
   6. Sıfırlama düğmesine basın ve makinenin dikdörtgen şekilli doku (ikinci tur) oluşturarak dokuyu tekrar kesmesine izin verin.
   7. Plastik diski işlenmiş malzeme ile çıkarın ve doku spatulası kullanarak sadece tümör dokusunu dikkatlice 90° döndürün.
   8. Plastik diski kesme tablasına yerleştirin, ardından serbest bırakma tablası düğmesini başlangıç moduna ayarlayın ve son bir kesme turu (üçüncü tur) için sıfırlama düğmesine basın.
   9. Doğrayıcıyı kapatın ve plastik diski çıkarın. Doğrayıcıyı ve bıçakları temizleyin.
   10. 5 mL'lik tek kanallı bir pipet kullanarak, işlenmiş malzemeyi ortamla birlikte pipete aspire edin ve süspansiyonu tekrar tabağa akıtın.
   11. Dokuyu düzgün bir şekilde ayırmak için önceki adımı 2-3 kez tekrarlayın.
   12. Petri kabını tekrar buzun üzerine yerleştirin ve her tümörün diğer 5 kabı ile adımları (4.1.1-4.1.12.) tekrarlayın.
2. Tümör dokusunun manuel olarak işlenmesi (M yöntemi)
   1. Tümör dokusunu ilk plastik Petri kabından (adım 2.5) 3 mL H-GPSA ortamı (Tablo 2) ile birlikte bir cam Petri kabına aktarın. Segmenti mikroskop altında manuel olarak iki neşter kullanarak 0,5 mm'lik bölümlere ayırın.
   2. Diseke edilen dokuyu 2 mL'lik bir pipet kullanarak plastik Petri kabına geri aktarın.
   3. Diğer beş Petri kabındaki tümör bölümleri için adımları tekrarlayın (adım 2.5).

5. Tümör dokusunun yıkanması

1. Her Petri kabını 45°'ye kadar yukarı doğru eğin ve tümör parçaları kabın dibine çökene kadar 30 saniye bekleyin.
2. 1 mL'lik bir pipet kullanarak 2.5 mL H-GPSA ortamını (Tablo 2) dikkatlice aspire edin ve herhangi bir tümör dokusu almamaya dikkat edin.
3. Her numuneye 2 mL RBC lizis tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). İşlenen tümör parçaları tamamen lizis tamponu ile kaplanmalıdır.
4. 6 tabağı 10 dakika boyunca yavaş hızda bir laboratuvar yörünge sallama makinesine yerleştirin.
5. Herhangi bir tümör dokusunu almamak için lizis tamponunun 2 mL'sini dikkatlice aspire edin.
6. Her seferinde lizis tamponu yerine 2 mL H-GPSA ortamı (Tablo 2) kullanarak önceki yıkama adımlarını (adım 5.1-5.5) iki kez tekrarlayın.

6. Tümör dokusunun kültürlenmesi

1. Her bir tabaktan H-GPSA ortamını (Tablo 2) aspire edin ve 4 mL PDO ortamı (Tablo 2) ile değiştirin.
2. Her bir tabağın doku parçalarını, ultra düşük ataşmanlı 6 oyuklu bir plakanın ilgili bir kuyucuğuna aktarın (bkz.
3. Plakayı bir inkübatörün içindeki bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 2-4 hafta boyunca 37 °C,% 5 CO₂ ve 150 rpm'de inkübe edin.
4. Her bir oyuktan 2 mL ortam aspire ederek ve bunu 37 ° C'ye önceden ısıtılmış 2 mL taze PDO ortamı (Tablo 2) ile değiştirerek her iki günde bir yarım orta değişim gerçekleştirin.
5. Doku hipoksisini önlemek için dokuyu mikroskop altında gözlemleyin (morfoloji, büyüme, orta renk) ve büyüyen PDO'ları (>0.7 mm) veya yapışkan dokuyu kesin.
   1. Bunu yapmak için, PDO'ları ultra düşük ataşman kuyusundan sterilize edilmiş bir cam Petri kabına aktarın ve kesmek için bir neşter kullanın. Alternatif olarak, yapışkan PDO'lar 1 mL'lik bir pipetle aspire edilerek çözülebilir. PDO'ları sıkmamaya ve nazikçe tutmamaya dikkat edin.
6. Her iki günde bir PDO'yu sayarak PDO oluşumunu değerlendirin ve istenen yuvarlak morfolojiyi iyice kontrol edin (Şekil 2).

7. PDO'ların sabitlenmesi ve gömülmesi

1. 6 haftalık kültürden sonra 24 saat boyunca% 4 formalin ile her hastanın her kuyusundan iki PDO sabitleyin.
2. Sabit PDO'ları gömülene kadar nötr tamponlu (sodyum fosfat) formaline daldırın.
3. Daha fazla işlem için her PDO'yu bir kasete yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Kaseti aşağıdaki NOT'ta belirtildiği gibi aşağıdaki solüsyonlara daldırarak bir dehidrasyon işlemi başlatın:
   NOT: 20 dakika %50 etanol, 20 dakika %70 etanol, 20 dakika %80 etanol, 20 dakika %96 etanol, 20 dakika %100 etanol, 30 dakika %100 etanol, 30 dakika %100 etanol + kloroform (1:1 oran), 30 dakika %100 etanol + kloroform (1:1 oran), 30 dakika mutlak kloroform, 30 dakika mutlak kloroform, 30 dakika parafin, STP 120 kullanarak 30 dakika parafin.
5. Susuz PDO'ları 58-60 °C'de parafin mumuna gömün.
6. Gömülü PDO'ları 2,5 μm kalınlığında dilimleyin ve boyama için slaytlara monte edin.

8. İmmünofloresan boyama

1. PDO'ları 6 haftalık kültürden sonra monte edin.
2. Daha sonra, daha önce bildirildiği gibi, glial fibriler asidik proteine (GFAP, seyreltme: 1:100) ve proliferasyon belirteci Ki67'ye (seyreltme: 1:1000) (bkz. Malzeme Tablosu) karşı çift boyama yapın²².
3. Benzer şekilde, GFAP ve anti-kaspaz-3'e (CC3, seyreltme: 1:400) karşı PDO'ları çift boyayarak apoptozu değerlendirin (bkz.
4. 40x büyütmede bir floresan mikroskobu kullanarak PDO'ların görüntülerini yakalayın.
5. GFAP-, Ki67- ve CC3-pozitif hücrelerin yanı sıra GFAP/Ki67 ve GFAP/CC3 çift pozitif hücreler için görüntüleri analiz edin.
6. Görüntü analizi için açık kaynaklı Fiji (ImageJ-win 32) programını kullanın.

9. Değerlendirme ve veri analizi

1. Kültürün ilk haftasında standart ayarlarda ve 5x büyütmede günlük mikroskobik parlak alan resimleri çekin.
2. Morfolojik değişiklikleri gözlemleyin ve hem manuel hem de otomatik işleme yaklaşımlarında olgunlaşma sürecini takip edin.
3. Standart parlak alan modu ayarlarında mikroskobu kullanarak morfolojik analiz yapın.
4. Beş hastanın hepsinden PDO'larda kültürün ilk 4 haftasında PDO sayısını ve morfolojisini değerlendirin.
5. Ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatasını hesaplamak için her hastadan her PDO sayısının üç okumasını alın.
6. Üç hastadan PDO'larda proliferasyon ve apoptozu araştırın.
7. Piyasada bulunan bir istatistiksel yazılım paketi kullanarak verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
8. PDO sayısı, proliferasyon ve apoptoz açısından manuel ve otomatik PDO üretimi arasındaki farkları belirlemek için Students-T ve Mann-Whitney U Testlerini uygulayın.

Tartışmalar

Bu çalışma, PDO'ların oluşturulması için hızlı ve etkili bir yöntem sunmaktadır. GBM, genellikle nüks ve yüksek hastalık yükü ile karakterize, tedavisi zor bir tümör olmaya devam etmektedir ^3,6. Yenilikçi terapötik yaklaşımlara acilen ihtiyaç duyulmaktadır, çünkü in vitro olarak gözlenen umut verici sonuçlar genellikle faz-I denemeleri sırasında in vivo etkinlik gösterememektedir. Bu tutarsızlığın nedenlerinden biri, tek katmanlı kültürlerde yetiştirilen, hasta kaynaklı ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinin, ebeveyn tümörünün karmaşık hücre-hücre etkileşimlerini ve genetik özelliklerini yansıtma yeteneğinin sınırlı olması olabilir. GBM^8,9'un yüksek inter- ve intratümöral heterojenliği göz önüne alındığında, kişiselleştirilmiş hedefe yönelik tedaviler tercih edilir ve gelecekteki uygulamalar için umut vaat edebilir. 2D yapışık hücre hatlarının aksine, organoidler ebeveyn dokusunun²¹ özelliklerini koruma yeteneğine sahiptir, ancak tümör ve normal beyin arasındaki karmaşık hücre-hücre etkileşimleri çok önemlidir ve bu model tarafından potansiyel olarak göz ardı edilebilir. Bununla birlikte, PDO'ların manuel olarak oluşturulması zaman alıcı bir süreçtir ve kesim sırasında neşterlerle sıkmanın neden olduğu doku hasarı, başarılı PDO büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, daha az zaman ve çabayla daha fazla sayıda PDO üretmek için bir doku kıyıcı kullanılarak otomatik bir yöntem optimize edildi. Ek olarak, genel proliferasyon ve apoptoz oranlarının iki yaklaşım arasında farklılık göstermediğini gösterdik.

C yaklaşımı basittir, uygulanması kolaydır ve daha fazla sayıda PDO oluşturulmasını sağlar (Şekil 3). Dokunun ikinci ve üçüncü doğrama turları arasındaki rotasyonu, protokolde kritik bir adım olarak tanımlandı. Bu aşamada, doku zaten bütünlüğünü kaybetmiştir ve kolayca parçalanabilir, bu da mikroskop altında ek kesim veya manuel diseksiyon gerektiren daha büyük parçalara neden olur. Otomatik kıyıcı yaklaşımı, daha yüksek doğrulukla önceden ayarlanmış bir kesme boyutuna izin verirken, manuel yaklaşım, PDO'ların boyutunu belirlemede hassasiyetten yoksundur ve bu da karşılaştırmalı ilaç taraması için bir dezavantaj olan eşit olmayan şekilli ve boyutlu PDO'lara yol açar (Şekil 2). Bununla birlikte, önerilen yöntemle, PDO başına hücre sayılarının standardizasyonu sağlanamamakta ve bu da potansiyel olarak standartlaştırılmış ilaç tarama protokolleri için bir dezavantaj oluşturmaktadır. Farklı organoid üretim tekniklerinin avantaj ve dezavantajları 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36^,
37,38,39,40,41,42 ve uygulamaları Tablo 3'te özetlenmiştir.

GBM dokusunun kıvamı, sertten (infiltrasyon bölgesi) yumuşaka (nekrotik çekirdek) kadar değişebilir ve bu da otomatik kıyıcı yaklaşımı için zorluklar oluşturabilir. Doku çok sertse, doğrayıcı onu sıkıştırabilir ve zarar verebilirken, çok yumuşak doku ezilebilir. Seçilen doku, kahverengi veya sarı renk değişikliği göstermek yerine ara sıra pembemsi-grimsi bir renklenmeye sahip orta düzeyde sıkılık da dahil olmak üzere ayırt edici özellikler sergiledi. Süngerimsi ve kolayca ufalanabilen bir dokuya sahip olan doku, agaroz blokları içinde üstün koruma gösterirken, aşırı derecede hassas ve sıvılaştırılmış tümör dokusu örnekleme prosedüründen çıkarıldı. Bununla birlikte, kıyıcı yaklaşımı, optimal olmayan kıvamdaki dokularda bile, manuel yaklaşıma kıyasla daha fazla sayıda PDO'nun başarılı bir şekilde oluşturulmasını sağladı. Anahtar çözüm, tümörün farklı bölgelerinden dokuyu işlemek için tümör rezeksiyonunu yapan cerrahla yakın etkileşimi sürdürmektir. Optimal olmayan doku kıvamı durumlarında, dokuyu mikroskop altında manuel olarak yeniden işlemek, doğramadan sonra yararlı bir katkı oldu. Heterojenliği hesaba katmak için, tümör dokusu başlangıçta altı segmente ayrıldı ve her biri daha sonra C veya M yaklaşımı için yarıya indirildi. Bu altı farklı bölümde, önemli derecede heterojenlik beklenmektedir. Ayrıca, aynı bölümden veya kuyudan PDO'lar içinde bile, farklı alt popülasyonların varlığı akla yatkındır.

Kavram kanıtı olarak, iki GBM'li hastadan ve LGG'li bir hastadan proliferasyon ve apoptoz verileri bildirildi ve iki yöntem arasında anlamlı bir fark görülmedi. PDO'ların oluşumu yüksek derecede kötü huylu beyin tümörleri ile sınırlı değildir, aynı zamanda LGG'lere de uygulanabilir. Bu çalışma, LGG'nin 2D kültürde nadiren büyüme gösterdiğini ve çalışmaları için doğru bir modelin geliştirilmesini oldukça değerli hale getirdiğini vurgulamaktadır. Bu protokol, GBM'den ve LGG'den PDO'ların hızlı ve etkili bir şekilde üretilmesinde bu yaklaşımın çok yönlülüğünü göstermeyi amaçlamaktadır.

Genel olarak, PDO'lar gelecekte malign beyin tümörlerinde hedefe yönelik tedavilerin hasta odaklı tedavi öncesi testleri için kullanılabilir. Bireyselleştirilmiş ilaç taraması için hızlı ve etkili bir yöntem sağlamak çok önemlidir, çünkü tümör ilerlemesi hızla gerçekleşir ve kurtarma tedavisi seçeneklerine umutsuzca ihtiyaç duyulur. Bir sonraki adım olarak, PDO modeli, gerçek tedavi yanıtlarını daha iyi taklit etmek için çeşitli immünoterapötik yaklaşımlarla değerlendirilebilir. Gelecekte, PDO'lar, klinik bir ortamda tedavilerin daha fazla araştırılması ve değerlendirilmesi ihtiyacına ilişkin karmaşık sonuçlar çıkarmak için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985023
30% formaldehyde methanol-free	Carl Roth	4235.1	Used in 4% concentration
70% ethanol solution			For sterilisation
Agarose tablets 0.5 g	Carl Roth	HP67.7
Amphotericin B 250 µg/mL	Gibco	15290018
Anatomical forceps	Hartstein	N/A
Anatomical spatula	Hartstein	N/A
B-27 Supplement without vitamin A (50x)	Gibco	12587010
Biopsy cassette with cover	Resolab	37001-b
Blades for McIlwain Tissue Chopper	Campden instruments	Model TC752-1
CC3 antibody (Asp 175)	Cells signaling technology	9661
Disposable scalpel	Feather	0200130015
Distilled water	Gibco	15230089	To dilute the formaldehyd
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x)	Gibco	11330032	Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Life Sciences	D8537-500ML	Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	433357
Falcon tube 50 ml Cellstar	Greiner Bio-One	227261
GFAP antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc33673
Glass beaker	N/A	N/A
Glass petri dish	N/A	N/A
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050061
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo scientific	51032875
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet	Thermo scientific	5016643
Hibernate-A	Gibco	A1247501
Histoacryl glue	B. Braun surgical	1050052
Human Insulin, Solution	Santa Cruz Biotechnology	sc-360248
Ice box	N/A	N/A
Ki67 antibody	Abcam	ab16667
McIlwain Tissue Chopper	Cavey Laboratory Engineering	51350V
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B	Leica	DMI6000B	For brightfield and immunofluorescence pictures
Microscope stereozoom S9D	Leica	W841832	For manual cutting and to organoids monitoring
Microwave	Bosch	N/A	To heat the agarose solution
Mounting plastic discs	Cavey Laboratory Engineering	51354
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x)	Gibco	11140050
Neurobasal (1x)	Gibco	21103049
Orbital shaking machine Rotamax120	Heidolph	10304491
Penicilin Streptomycin	Gibco	15140122
Plastic petri dishes Cellstar	greiner bio-one	628160	n = 12
Single channel pipette 1000 µm	Eppendorf	4924000010
Single channel pipette 5000 µm	Eppendorf	EP3123000276
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0	IBM
Surgipath Paraplast	Leica	39601006	Embedding medium
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate	Thermo Scientific	174932