Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Özet

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

Özet

Vertebral kolon bir omurgalıyı tanımlar ve omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik kanalını şekillendirir. Memeli merkezi sinir sisteminin uygun gelişimi ve işlevi, önemli ölçüde mikroglia olarak bilinen yerleşik makrofajların aktivitesine dayanır. Mikroglia, omurilik ve beyinde farklı gen ekspresyonu ve davranışı sağlayan heterojenlik ve çok işlevlilik gösterir. Çok sayıda çalışma, saflaştırma yöntemlerini kapsamlı bir şekilde detaylandıran serebral mikroglia fonksiyonunu araştırmıştır. Bununla birlikte, farelerde mikroglia'nın omurilikten saflaştırılması kapsamlı bir açıklamadan yoksundur. Buna karşılık, rafine edilmemiş bir ekstraktın aksine, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenazın kullanılması, merkezi sinir sistemi dokularında raporlamadan yoksundur. Bu çalışmada, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden vertebral kolon ve omurilik eksize edildi. Sonraki sindirim, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz kullandı ve mikroglia saflaştırması, bir yoğunluk gradyanı kullandı. Hücreler, CD11b ve CD45 boyama yoluyla canlılık ve saflığı değerlendiren akış sitometrisi için boyandı. Sonuçlar ortalama %80 canlılık ve ortalama %95 saflık verdi. Sonuç olarak, fare mikrogliasının manipülasyonu, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz ve ardından bir yoğunluk gradyanı ile sindirimi içeriyordu. Bu yaklaşım, önemli miktarda omurilik mikroglia popülasyonunu etkili bir şekilde üretti.

Giriş

Omurgalıların tanımlayıcı özelliği, notokordun yerini, omurlar arası disklere bölünmüş, omur adı verilen bir dizi parçalı kemik ile değiştirdiği vertebral kolon veya omurgadır. Bu kemik materyalinin art arda gelmesi, omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik^kanalını şekillendirir 1. Rodentia cinsinde, omurga genellikle yedi servikal omur, on üç torasik omur, altı lomber omur ve değişken sayıda kaudal vertebradan^{oluşur 2,3}. Omuriliğin uzunluğu omurganınkine benzer ve terminal filum, omuriliği sakruma bağlayan sinirsel olmayan bir yapıdır. Ek olarak, sinir lifleri ....

Protokol

Çalışma, resmi Meksika standardı NOM-062-ZOO-1999'a ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuza uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma için onay, Meksika Çocuk Hastanesi Araştırma, Etik ve Biyogüvenlik Komitelerinden (HIM/2023/006) ve Meksika Eduardo Liceaga Genel Hastanesi Araştırma ve Biyoetik Komitesinden (DI/21/501/04/62) alınmıştır. Yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişen üç C57BL/6 faresi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak havalandırmalı raflarda izole koşullar altında yetiştirildikleri Meksika Çocuk Hastanesi'nden elde edildi.

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması<....

Tartışmalar

Beyin homeostazındaki önemi nedeniyle mikroglia çalışması için çok sayıda protokol geliştirilmiştir. Bu yöntemlerde, mikroglia tipik olarak embriyonik veya yenidoğan sıçanların ve farelerin serebral hemisferlerinden^{kaynaklanır 17}. Sınırlı sayıda çalışma, yetişkin farelerin omuriliklerinden mikroglia'nın saflaştırılmasını ele almıştır^13,14. Bu teknikler, genellikle Percoll veya OptiPrep kullanılarak gradya.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining