Canlı fare sperminde akrozomal kalsiyum dinamiği ve ekzositozun gerçek zamanlı görüntülenmesi

Özet

Burada açıklanan AcroSensE fare modeli ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri, sperm akrozomunun hücre altı bölmesindeki kalsiyum dinamiklerini ve bunların membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar.

Özet

Spermin tek ekzositik vezikülünün plazma zarı ile birleştiği akrozom ekzositozu (AE), döllenme için gerekli olan karmaşık, kalsiyuma bağımlı bir süreçtir. Bununla birlikte, kalsiyum sinyalinin AE'yi nasıl düzenlediğine dair anlayışımız hala eksiktir. Özellikle, intraakrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye giden ara adımlar arasındaki etkileşim iyi tanımlanmamıştır. Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ve bunların membran füzyonu ve ardından akrozom vezikülünün ekzositozu ile ilişkisi hakkında uzamsal ve zamansal bilgiler sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, Ekzositoz için Akrozom hedefli bir Sensörü (AcroSensE) eksprese eden yeni bir transgenik fare kullanır. Sensör, mCherry ile kaynaşmış genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini (GCaMP) birleştirir. Bu füzyon proteini, akrozomal kalsiyum dinamiği ve membran füzyon olaylarının eşzamanlı gözlemini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Canlı AcroSensE sperminde akrozomal kalsiyum dinamiklerinin ve AE'nin gerçek zamanlı izlenmesi, yüksek kare hızlı görüntüleme ve tek spermi hedefleyebilen bir uyarıcı dağıtım sisteminin bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Bu protokol ayrıca ham verileri ölçmek ve analiz etmek için birkaç temel yöntem örneği sağlar. AcroSensE modeli genetik olarak kodlandığından, diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme (CRISPR) tabanlı yöntemler gibi hazır genetik araçlar kullanılarak bilimsel önemi artırılabilir. Bu strateji ile ek sinyal yolaklarının sperm kapasitasyonu ve döllenmedeki rolleri çözülebilir. Özetle, burada açıklanan yöntem, belirli bir hücre altı bölmedeki (sperm akrozomunda) kalsiyum dinamiklerini ve bu dinamiklerin membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için uygun ve etkili bir araç sağlar.

Giriş

Sperm, kapasitasyon¹ adı verilen bir işlem sırasında döllenme yeteneği kazanır. Bu sürecin bir son noktası, spermin AE'ye girme yeteneğini kazanmasıdır. Yirmi yılı aşkın veriler, memeli sperminde karmaşık, çok adımlı bir AE modelinin varlığını desteklemektedir (^2,3'te özetlenmiştir). Bununla birlikte, AE'yi canlı spermde incelemek zordur ve bu süreci yeterli çözünürlükle izlemek için şu anda mevcut olan yöntemler zahmetlidir ve birden fazla hazırlık adımı gerektirir⁴, AE'nin son adımının tespiti ile sınırlıdır (ör., PNA⁵ kullanılarak), sit....

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri yönergelere göre gerçekleştirildi ve Cornell Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (#2002-0095). Bu çalışma için 8-10 haftalık AcroSensE fareleri² kullanıldı. AcroSensE farelerin kullanılabilirliği hakkında bilgi talepleri ilgili yazara gönderilebilir.

1. Sperm toplama ve yıkama

1. AcroSensE farelerinden kauda epididimal spermi toplayın (bu prosedürle ilgili daha fazla ayrıntı^11'de verilmiştir). 37 ° C'de 0,5 mL Modifiye Whitten ortamı (MW) içeren 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabında 15 dakikalık yüzm....

Tartışmalar

Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye yol açan ara adımlar arasındaki etkileşimin gerçek zamanlı, tek hücreli izlenmesi ve analizi için yeni oluşturulan AcroSensE fare modelini kullanmak için mikroskopi tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme gibi hazır genetik yaklaşımlarla birlikte, bu model ve yöntem, kapasitasyon, AE ve döllenme ile ilgili sperm sinyal yollarında yer alan çeşitli bileşenlerin ve yolların rolünü incelemek .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III