Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Özet

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Özet

Kadın infertilitesinin nedenlerini anlamada en büyük zorluk, oosit adı verilen dişi germ hücrelerinin gelişimini yöneten mekanizmaları aydınlatmaktır. Gelişimleri, embriyogenezi başlatmak için oositi sperm ile füzyona hazırlayan iki kritik aşama olan hücre büyümesi ve müteakip bölünmeler ile işaretlenir. Büyüme sırasında, oositler sitoplazmalarını çekirdeği hücre merkezinde konumlandırmak için yeniden düzenlerler, bu da farelerde ve insanlarda başarılı oosit gelişimini ve dolayısıyla embriyojenik potansiyellerini öngören bir olaydır. Fare oositlerinde, bu sitoplazmik yeniden düzenlemenin, aktivitesi çekirdeğe giren, yeniden konumlandıran ve nüfuz eden mekanik kuvvetler üreten hücre iskeleti tarafından yönlendirildiği gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu sitoplazmik-nükleoplazmik kuvvet iletimi, biyomoleküler kondensatlar olarak bilinen nükleer RNA işleme organellerinin dinamiklerini ayarlar. Bu protokol, fare oositlerinde uzamsal ölçekler boyunca hücre iskeletinin çekirdek üzerindeki etkisini yüksek zamansal çözünürlükle belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. i) oosit sitoplazmasındaki hücre iskeleti aktivitesini, ii) oosit çekirdeğinin hücre iskeleti bazlı ajitasyonunu ve iii) oosit nükleoplazmasındaki biyomoleküler kondensat dinamikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerekli görüntüleme ve görüntü analizi adımlarını ve araçlarını detaylandırır. Oosit biyolojisinin ötesinde, burada detaylandırılan yöntemler, ölçekler arasında nükleer dinamiklerin hücre iskeletine dayalı ayarını benzer şekilde ele almak için somatik hücrelerde kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Giriş

Nükleer konumlandırma, çoklu hücresel ve gelişimsel işlevler için gereklidir 1,2,3,4,5. Oosit adı verilen memeli dişi germ hücreleri, boyut olarak asimetrik bir bölünmeye uğramasına rağmen, çekirdeği hücre merkezinde konumlandırmak için sitoplazmalarını yeniden şekillendirir, bu da sonraki kromozomun merkezden uzaklaşmasına^{dayanır 6} (Şekil 1). Çekirdeğin bu merkezlenmesi, farelerde ve insanlarda başarılı oosit gelişimini ^7,8<....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa Topluluğu'nun yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Fransa Tarım Bakanlığı (yetki No. 75-1170) ve Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GDO anlaşma numarası DUO-5291). Fareler, 22-24 °C ortam sıcaklığı ve %40-50 nem oranı ile 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde hayvan tesisine yerleştirildi. Burada kullanılan fareler arasında dişi OF1 (Oncins France 1, 8 ila 12 haftalık) ve dişi C57BL / 6 (10 ila 14 haftalık) bulunur.

1. Oosit toplama ve hazırlama

1. ¹⁸ ve^19'da tarif edildiği gibi 8 ila 14 haftalık fare....

Tartışmalar

Bu protokoldeki temel adımlar, oositlerin hayatta kalmalarını veya normal işlevlerini^{etkilemeden uygun mikroenjeksiyonunu içerir 9,10,11} ve ayrıca nükleer benekler gibi ilgili yapıların doğru görselleştirilmesine izin verecek önceden tanımlanmış miktarlarda cRNA'nın mikroenjekte edilmesini içerir.

Sitoplazmik ve (intra)-nükleer dinamikler arasındaki bağlantıyı kurmak, hücre isk.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows