Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Özet

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Özet

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler), hedeflenen hücre popülasyonlarında hücre içi kalsiyumdaki değişiklikleri izlemek için görüntüleme tekniklerini sağlar. Büyük sinyal-gürültü oranları, GECI'leri duyusal nöronlarda uyaranla uyarılan aktiviteyi tespit etmek için güçlü bir araç haline getirir. GECI'ler, aynı anda incelenebilen nöron sayısı ile uyaran kodlamasının popülasyon düzeyinde analizini kolaylaştırır. Bu popülasyon kodlaması en uygun şekilde in vivo olarak yapılır. Boynun altındaki somatik ve viseral yapıları innerve eden duyusal nöronların somasını barındıran dorsal kök gangliyonları (DRG), bu yapılara nispeten kolay erişilebildiği için en yaygın olarak in vivo görüntülemede kullanılır. Daha yakın zamanlarda, bu teknik farelerde oral ve kraniyofasiyal yapıları innerve eden trigeminal gangliondaki (TG) duyusal nöronları incelemek için kullanıldı. DRG'ye ek olarak, trigeminal nevralji gibi duyusal nöron aktivitesindeki değişiklikleri yansıtıyor gibi görünen oral ve kraniyofasiyal yapılara özgü ağrı sendromlarının uzun listesi de dahil olmak üzere TG'yi incelemek için birçok neden vardır. Fareler, genetik araçların mevcudiyeti nedeniyle DRG ve TG nöronlarının çalışmasında en yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, boyut, kullanım kolaylığı ve potansiyel olarak önemli tür farklılıklarındaki farklılıklarla, fare TG nöronlarından ziyade sıçanları incelemek için nedenler vardır. Bu nedenle, sıçan TG nöronlarını in vivo görüntülemek için bir yaklaşım geliştirdik. Yenidoğan yavrularına (p2) intraperitoneal olarak GCaMP6'ları kodlayan bir AAV enjekte ettik ve hem TG hem de DRG nöronlarının %>90 enfeksiyonu ile sonuçlandı. Kraniyotomi ve dekortikasyonu takiben erişkinlerde TG görüntülendi ve yüzün mandibular ve maksiller bölgelerinin uyarılmasını takiben TG nöronlarında GCaMP6s floresansındaki değişiklikler izlendi. Floresanstaki artışların periferik sinir bloğu ile uyaran olarak uyarıldığını doğruladık. Bu yaklaşımın birçok potansiyel kullanımı olsa da, periferik sinir hasarını takiben değişen TG nöronlarının alt popülasyonlarını karakterize etmek için kullanıyoruz.

Giriş

Cilde veya kaslar, kemik ve iç organlar dahil olmak üzere diğer vücut yapılarına etki eden mekanik, termal ve kimyasal uyaranların sinirsel kodlaması olan somatosensation, bu yapıları innerve eden birincil afferent nöronlardaki aktivite ile başlar¹. Tek birim tabanlı elektrofizyolojik yaklaşımlar, bu süreçte yer alan afferent alt tipler ve bunların uyaran-tepki özelliklerinin zaman içinde nasıl değişebileceği hakkında zengin bilgiler sağlamıştır ^1,2,3. Bununla birlikte, spesifik duyusal modalitelerin nöronların spesifik alt popülasyonları tarafından ta....

Protokol

Araştırmada hayvanların kullanımını içeren tüm deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Uluslararası Ağrı Araştırmaları Derneği tarafından ortaya konan standartlara uygun olarak gerçekleştirildi ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (protokol #22051100). Her deneyin sonunda, sıçanlar, Amerikan Veteriner Hekimler Birliği ve Pittsburgh Üniversitesi IACUC tarafından onaylanan bir yaklaşım olan buz gibi soğuk fosfat tamponlu salinin (PBS) kardiyak perfüzyonu ile ekzaninasyon yoluyla ötenazi yapıldı.

1. GCaMP indüksiyonu

1. Yavruların doğumdan sonra uygun zamanda enjekt....

Tartışmalar

Burada, TG'yi görüntülemek için bir GECI sıçanı üretmenin hızlı, invaziv olmayan bir yolunu gösteriyoruz. Yüksek düzeyde gen ekspresyonunu sürmek ve sürdürmek için bir CAG promotoru seçtik. Önceki çalışmalar, diğer AAV serotiplerinin DRG nöronlarında^gen ekspresyonunu etkili bir şekilde yönlendirebileceğini öne sürerken, sonuçlarımız yenidoğanlarda³² AAV'nin intraperitoneal enjeksiyonunu içeren yeni bir çalışma ile tutarlıdır ve AAV9 s.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500