Fare Hipokampusu ve Prefrontal korteksinde ikili hücre dışı kayıtlar

Özet

Bu protokol, yerel alan potansiyellerini kaydetmek ve fare hipokampusu ve prefrontal korteksindeki bilgi akışını araştırmak için özel olarak tasarlanmış bir kayıt cihazının ve elektrotların kullanımını ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Yerel alan potansiyellerini (LFP'ler) kaydetme tekniği, lokalize nöronal popülasyonların elektriksel aktivitesini ölçmek için kullanılan elektrofizyolojik bir yöntemdir. Bilişsel araştırmalarda, özellikle hipokampus ve prefrontal korteks gibi beyin bölgelerinde çok önemli bir araç olarak hizmet eder. Bu alanlar arasındaki çift LFP kayıtları, bölgeler arası sinyal iletişiminin araştırılmasına izin verdikleri için özellikle ilgi çekicidir. Bununla birlikte, bu kayıtları gerçekleştirme yöntemleri nadiren tanımlanmıştır ve çoğu ticari kayıt cihazı ya pahalıdır ya da belirli deneysel tasarımları barındırmak için uyarlanabilirlikten yoksundur. Bu çalışma, antipsikotik ilaçların ve potasyum kanal modülatörlerinin bu alanlardaki LFP özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmak için fare hipokampusu ve prefrontal korteksinde çift elektrotlu LFP kayıtları yapmak için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Teknik, her bir beyin bölgesindeki güç spektrumları ve ikisi arasındaki tutarlılık dahil olmak üzere LFP özelliklerinin ölçülmesini sağlar. Ek olarak, bu deneyler için düşük maliyetli, özel olarak tasarlanmış bir kayıt cihazı geliştirilmiştir. Özetle, bu protokol, beynin farklı bölgelerinde yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip sinyalleri kaydetmek için bir araç sağlayarak, beyin içindeki bölgeler arası bilgi iletişiminin araştırılmasını kolaylaştırır.

Giriş

Yerel alan potansiyelleri (LFP'ler), lokalize bir nöron grubunun kolektif aktivitesini yansıtan, hücre dışı boşluktan kaydedilen elektriksel aktiviteyi ifade eder. 1 Hz'deki yavaş dalgalardan 100 Hz veya 200 Hz'deki hızlı salınımlara kadar uzanan çok çeşitli frekanslar sergilerler. Belirli frekans bantları, öğrenme, hafıza ve karar verme gibi bilişsel işlevlerle ilişkilendirilmiştir ^1,2. LFP özelliklerindeki değişiklikler, demans ve şizofreni dahil olmak üzere çeşitli nörolojik bozukluklar için biyobelirteç olarak kullanılmıştır ^3,4. LFP kayıtlarını analiz etmek, bu koşullarla ilişkili altta yatan patolojik mekanizmalar ve potansiyel terapötik stratejiler hakkında değerli bilgiler sunabilir.

Çift LFP kaydı, iki spesifik beyin bölgesi içinde ve arasında lokalize elektriksel aktiviteyi ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Bu teknik, farklı beyin bölgeleri içinde ve arasında meydana gelen karmaşık nöral dinamikleri ve sinyal iletişimini araştırmak için değerli bir fırsat sağlar. Önceki çalışmalar, bireysel beyin bölgelerinin nöronal özelliklerindeki değişikliklerin tespit edilmesinin karmaşık olabileceğini, ancak bölgeler arası kortikal iletişimdeki değişikliklerin gözlemlenebileceğini ortaya koymuştur ^5,6. Bu nedenle, çift LFP kaydının kullanılması, bu sorunu çözmek için güçlü bir yol sunar.

Hipokampal-prefrontal bağlantı, bilişsel işlevlerin modüle edilmesinde çok önemli bir rol oynar ve işlev bozukluğu çeşitli nörolojik bozukluklarla ilişkilendirilmiştir ^7,8. Bu bölgelerin çift elektrot kayıtları, bu etkileşimler hakkında bilgi sağlayabilir. Ne yazık ki, bu alanlar arasında çift elektrotlu LFP kayıtları gerçekleştirme yöntemleri hakkında sınırlı bilgi mevcuttur. Ayrıca, ticari olarak temin edilebilen kayıt cihazları genellikle pahalıdır ve belirli deneysel tasarımlara uyarlanabilirlikten yoksundur. LFP'leri kaydetmek için geleneksel yöntem, kayıt cihazını bir hayvanın beynine implante edilen elektrotlara bağlamak için korumalı bir kablo kullanmayı içerir. Ancak bu yaklaşım, kaydedilen sinyallerin kalitesini ve güvenilirliğini etkileyen hareket artefaktlarına ve çevresel gürültüye karşı hassastır.

Bu protokol, fare hipokampusunda ve prefrontal korteksinde çift elektrotlu LFP kayıtlarının gerçekleştirilmesi için, hayvanın kafasına yerleştirilebilen düşük maliyetli, özel olarak tasarlanmış bir kafa sahnesi kullanarak kapsamlı bir prosedürü açıklar. Bu yöntemler, araştırmacıların iki ayrı serebral bölge içinde bölgeye özgü salınım modellerini araştırmalarını ve bu alanlar arasındaki bölgeler arası bilgi alışverişini ve bağlantıyı keşfetmelerini sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma, Florey Hayvan Etik Komitesi (Melbourne Üniversitesi, No. 22-025UM) tarafından, hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için Avustralya yasasına uygun olarak onaylanmıştır. Bu çalışma için Hayvan Kaynakları Merkezi'nden (Avustralya) elde edilen C57BL / 6 erkek fareler (8 hafta) kullanıldı.

1. Headstage tasarımı ve imalatı

NOT: Headstage PCB kartı, doğrudan hayvanın kafasına yerleştirilmek üzere tasarlanmış kompakt 14 mm x 12 mm dört katmanlı bir karttır. Ticari bir amplifikatör çipi kullanır (Malzeme Tablosuna bakın) ve tüm tasarım ve Gerber dosyaları çevrimiçi olarak mevcuttur (GitHub bağlantısı: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. Üreticiye aşağıdaki özellikleri sağlayın: Levha kalınlığı: 0,6 mm; Minimum izleme/aralık: 4 mil; Minimum delik boyutu: 0,2 mm.
2. PCB montaj işlemi sırasında, şu sırayı izleyin:
   1. 350 °C'ye ayarlanmış bir sıcak hava tabancası kullanarak amplifikatör çipini karta lehimleyin.
   2. Pasif bileşenleri lehimleyin.
   3. SPI konektörünü ve elektrot konektörünü lehimleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
3. Kalite güvencesi için lehimlemeyi mikroskop altında inceleyin. Daha fazla stabilite için SPI konektörünü epoksi kullanarak yerine sabitleyin.
4. Sinyal alımı için üçüncü taraf kayıt yazılımı ve bir kontrol panosu ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Ayrıntılı talimatlar için yazılım kullanım kılavuzuna bakın.
5. Tasarlanan headstage 8 kanalı destekler. Yazılımda, kayıt için 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 ve 23 kanallarını etkinleştirin.

2. Elektrot imalatı

1. PFA kaplı tungsten telleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) farklı elektrot tipleri için belirli uzunluklarda kesin: prefrontal korteks elektrot (12 mm), hipokampus elektrot (10 mm) ve toprak elektrodu (6 mm).
2. Pirinç boruyu ( Malzeme Tablosuna bakın) 3 mm'lik parçalar halinde kesin.
3. Bir çakmak kullanarak her telin ucundaki kaplamanın 2 mm'sini çıkarın, ardından elektrot telini pirinç boruya güvenli bir şekilde lehimleyin. Pirinç borunun iç çapı 0,45 mm ve dış çapı 0,60 mm'dir.
4. Toprak elektrodu için, elektroda bir M1.2 paslanmaz çelik vida ( Malzeme Tablosuna bakın) lehimleyin. Lehimlemeyi geliştirmek için vidaya fosforik asit bazlı akı uygulayın. Lehimlemeden sonra vidayı alkol kullanarak temizleyin.
   NOT: Lehimleme işlemi sırasında koruma için eldiven giyin.

3. Cerrahi prosedür

1. Fareyi %3 izofluran ve 1 L/dk oksijen akışı olan bir anestezi odasında uyuşturun.
2. Anestezi uygulanmış fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin ve stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin (bkz.
3. İzofluranın bakım oranını% 2.5-3'e ayarlayın ve oksijen akışını 500 mL / dk'ya düşürün. Ayak parmağını sıkıştırarak hayvanın hala derin anestezi altında olup olmadığını doğrulayın.
4. Deri altına 0.5 mg / kg'da carprofen enjekte edin ve göz koruması için göz merhemi uygulayın.
5. Povidon-iyot ve% 80 etanol kullanarak farenin kafasını tıraş edin ve sterilize edin.
6. Kafa derisinin orta hattı boyunca 8 mm'lik bir kesi yapın ve kesi alanındaki bağ dokusunu çıkarın.
7. Kafatasının yüzeyini temizlemek için hidrojen peroksit uygulayın, çevredeki cilde dokunmamaya dikkat edin.
8. Doğru elektrot yerleşimi için bregma ve lambda yer işaretlerini aynı seviyeye hizalayın (bregma ve lambda, sagital sütürün koronal ve lambdoid sütürlerle kesiştiği yerlerdir).
9. Belirtilen koordinatlarda referans/topraklama elektrodu, ankraj vidaları (0,9 mm matkap çapağı) ve aktif elektrotlar (0,3 mm matkap çapağı) için delikler açın.
10. Özel yapım elektrodu (adım 2) stereotaksik çerçeve koluna takın ve beyne dik olduğundan emin olun.
11. Elektrodu hipokampal CA1 alanına implante edin (AP - 1.8 mm, ML - 1.3 mm, DV - 1.4 mm).
    NOT: AP, ön-arka; ML, mediolateral; DV, dorsoventral.
12. Prefrontal kortekste elektrot implantasyonunu tekrarlayın (AP - 2.0 mm, ML - 0.3 mm, DV - 1.7 mm).
13. Elektrotları piyasada bulunan güçlü bir yapıştırıcı ve diş çimentosu ile sabitleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
14. Hareketi önlemek için iki adet 1,2 mm ankraj vidası (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) implante edin.
15. Referans/topraklama elektrodunu, lambda yer işaretine 2 mm arka ve 2 mm tek taraflı dura mater ile doğrudan temas edecek şekilde konumlandırın.
16. Elektrotların pirinç boru tarafını, toprak elektrodu ortada olacak şekilde çok kanallı bir soket konektörüne ( Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın.
17. İzolasyon için orta pimin dışında 0.8 mm ısıyla daralan makaron kullanın.
18. Elektrotları, ankraj vidalarını ve konektörü yapıştırıcı ve diş çimentosu ile sabitleyin.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için, üç günlük bir süre boyunca ağrı değerlendirmesine dayanarak her 12-24 saatte bir deri altına 5-10 mg / kg'lık bir dozda carprofen enjekte edin.
2. Herhangi bir kayıt veya deneysel prosedüre başlamadan önce hayvana bir haftalık bir iyileşme süresi sağlayın.

5. Kayıt prosedürü

1. Hayvanı art arda üç gün boyunca günde iki kez 15 dakika boyunca kullanın.
2. Aşırı baskı uygulamadan elinizi etraflarına nazikçe kapatarak fareleri toplayın.
3. Sahne tahtasını art arda üç gün boyunca günde bir kez 30 dakika boyunca hayvanın kafasına yerleştirin.
4. Kayıt gününde, hayvanı 30 dakika boyunca kayıt odasına alıştırın.
5. Harici elektriksel paraziti azaltmak için hayvanı bir Faraday kafesi içindeki küçük bir kayıt odasına yerleştirin. Kayıt için özel headstage'i ekleyin.
6. Kayıt yazılımını açın ve 2,00 kHz'lik bir örnekleme hızı seçin. 13 ve 20 dışındaki tüm kanalları, her bir kanalı seçip boşluk çubuğuna basarak devre dışı bırakın.
7. Donanım bant genişliği penceresinde, alt bant genişliğini 2 Hz ve üst bant genişliğini 100 Hz olarak ayarlayın.
8. Yazılım filtreleme penceresinde, alçak geçiren filtreyi 100 Hz'e ve yüksek geçiren filtreyi 2 Hz'e ayarlayın.
9. Dosya Adı Seç'e tıklayarak depolama yolunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın.
10. Her kayıt seansına 10 dakikalık bir alışma süresi ve ardından 15 dakikalık bir başlangıç EEG kaydı ile başlayın.
11. Başlangıç kaydından sonra, ilacı intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulayın ve gecikmeden 30 dakika daha kayda devam edin.
    NOT: Kullanılan ilaçlarla ilgili ayrıntılar için Sonuçlar bölümüne bakın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada gösterilen sonuçlar, çeşitli ilaçların C57BL / 6 erkek farelerin dört kohortunda test edilen yerel alan potansiyelleri (LFP'ler) özellikleri üzerindeki etkilerini göstermektedir (her kohort için n = 8; yaş: 8 hafta; ağırlık: 24.0 ± 0.42 g). Test edilen ilaçlar arasında antipsikotik ilaç klozapin, potasyum kanal modülatörleri 4-Aminopiridin (4-AP) ve retigabin ile kontrol aracı salini vardı.

Şekil 1'de gösterildiği gibi, fare küç?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, hipokampus (HIP) ve prefrontal kortekste (PFC) ikili yerel alan potansiyellerinin (LFP'ler) eşzamanlı kaydı için özel olarak tasarlanmış özelleştirilmiş bir kafa aşaması oluşturma prosedürünü özetlemektedir. Bu protokolde sağlanan ayrıntılı adımlar, araştırmacıların hem her bölge içinde hem de HIP ile PFC arasındaki sinyal iletişimini kapsamlı bir şekilde incelemeleri için yeterli bilgi sunmaktadır.

Özel olarak tasarlanmış headstage...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast