JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, polietilen film ve amino asit çözeltisi ile oluşturulan yapay bir konakçı kullanarak Trichogramma dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Parazitoid yaban arıları, haşere biyokontrolü için paha biçilmez kaynaklar olarak hizmet eden çeşitli bir hymenopteran böcek grubudur. Başarılı parazitizm sağlamak için parazitoid yaban arıları, konakçılarının bağışıklığını bastırmak, konakçıların gelişimini, metabolizmasını ve hatta davranışlarını modüle etmek için konakçılarına zehir enjekte eder. 600.000'den fazla tahmini türle, parazitoid yaban arılarının çeşitliliği,, koni salyangozları ve örümcekler gibi diğer zehirli hayvanlarınkini geride bırakıyor. Parazitoid yaban arısı zehiri, haşere kontrolü ve tıpta potansiyel uygulamaları olan, yeterince keşfedilmemiş bir biyoaktif molekül kaynağıdır. Bununla birlikte, parazitoit zehrin toplanması, doğrudan veya elektriksel stimülasyonun kullanılamaması ve küçük boyutları nedeniyle diseksiyonun zorluğu nedeniyle zordur. Trichogramma , hem tarımda hem de ormanlarda lepidopteran zararlılarının biyolojik kontrolü için yaygın olarak kullanılan küçük (~0,5 mm) yumurta parazitoid yaban arısı cinsidir. Burada, yapay konakçılar kullanarak T. dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir yöntem bildiriyoruz. Bu yapay konakçılar, polietilen film ve amino asit çözeltileri ile oluşturulur ve daha sonra parazitizm için Trichogramma yaban arıları ile aşılanır. Zehir daha sonra toplandı ve konsantre edildi. Bu yöntem, zehir rezervuarı diseksiyon protokollerinde yaygın bir sorun olan diseksiyonun neden olduğu diğer dokulardan kontaminasyonu önlerken, büyük miktarlarda Trichogramma zehirinin çıkarılmasını sağlar. Bu yenilikçi yaklaşım, Trichogramma zehirinin incelenmesini kolaylaştırarak yeni araştırmaların ve potansiyel uygulamaların önünü açıyor.

Giriş

Parazitoid yaban arıları, biyolojik mücadele için önemli kaynaklar olan parazitik hymenopteran böceklerdir1. 600.000'den fazla tahmini türe sahip çok çeşitli parazitoid yaban arıları vardır2. Parazitoid yaban arılarının çeşitliliği,, koni salyangozları, örümcekler, akrepler ve arılar gibi diğer zehirli eklembacaklılarınkinden çok daha fazladır. Zehir, parazitoid yaban arılarında önemli bir parazit faktörüdür. Başarılı bir parazitizm için, konakçıya zehir enjekte edilir ve konakçının davranışını, bağışıklığını, gelişimini ve metabolizmasını modüle eder3. Dahası, parazitoid yaban arılarının zehiri, moleküler yapılarında, hedeflerinde ve işlevlerinde dikkate değer bir çeşitlilik gösterir ve konakçılarıyla karmaşık birlikte evrimi yansıtır. Bu nedenle, parazitoid zehir, böcek öldürücü veya tıbbi amaçlar için değerli ve yeterince takdir edilmeyen bir aktif molekül kaynağıdır4. Yılan, koni salyangoz, örümcek, akrep ve arı zehirinin aksine, parazitoid yaban arısı zehiri doğrudan stimülasyon veya elektriksel stimülasyon ile toplanamaz5. Parazitoid yaban arısı zehirinin çıkarılması için mevcut yöntem, zehir rezervuarını incelemektir. Bununla birlikte, parazitoid yaban arıları genellikle küçüktür ve parazitoid yaban arılarının diseksiyonu yüksek teknik beceriler gerektirir. Bu nedenle, parazitoid yaban arılarının zehirini verimli ve rahat bir şekilde toplamanın bir yolunu bulabilirsek, parazitoid yaban arılarının zehirini araştırmak çok yardımcı olacaktır.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae), küçük (~0.5 mm uzunluğunda) parazitoid yaban arılarının bir cinsidir6. Bu yaban arıları, özellikle hem tarımda hem de ormanlarda çeşitli lepidopteran zararlılarının yumurtalarını hedef alan en yaygın kullanılan biyokontrol ajanları arasındadır. Örneğin, Çin'de en yaygın kullanılan Trichogramma türlerinden biri olan T. dendrolimi, Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis ve Chilo suppressalis gibi çeşitli tarım ve ormancılık zararlılarını kontrol etmek için yaygın olarak uygulanmıştır. Önceki çalışmalar, Trichogramma yaban arılarının yumurtalarını yapay konakçılara enjekte edebildiğini gösterdi7. Balmumu8, agar9, Parafilm10 ve plastik film11 gibi malzemeler kullanılarak yapay konakçılar oluşturulabilir. Trichogramma için yeterli yumurtlamayı indükleyen yapay konakçılardaki çözelti, amino asitler veya inorganik tuzlargibi basit olabilir 12. T. dendrolimi'nin yapay konakçıları parazitleştirebilme özelliğine dayanarak, bu çalışma yapay konakçılar kullanarak parazitoid yaban arılarından zehir çıkarmak için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım, mevcut ekstraksiyon tekniklerinde düşük verim, düşük saflık ve kontaminasyona yatkınlık eksikliklerini gidermeyi amaçlamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, bilimsel araştırma ve biyoaktif moleküllerin böcek öldürücü veya tıbbi amaçlar için taranması ihtiyaçlarını karşılayan T. dendrolimi'den büyük miktarda yüksek saflıkta zehir ekstrakte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Böcek yetiştirme

  1. Corcyra cephalonica'yı mısır unu üzerinde 26 ± 1°C sıcaklıkta ve %40 ± %10 bağıl nemde besleyin.
  2. Breed T. dendrolimi suşu, iç mekanlarda Corcyra cephalonica'nın yumurtalarını konakçı olarak kullanarak Jilin böceğinden elde edilir. Yaban arısı yetişkinlerini besleyin Drosophila tüplerinde 26 ± 1 °C sıcaklıkta,% 70 ±% 10 bağıl nem, açık (L): 14 saat: 10 saat karanlık (D) döneminde% 10 sakaroz suyu.

2. Polietilen plastik film yumurta kartlarının hazırlanması

  1. 16 cm uzunluğunda, 12 cm genişliğinde ve 20 μm kalınlığında bir polietilen plastik film alın. 96 delikli standart PCR plaka düzenine göre bir cam taşlama çubuğu kullanarak 2-3 mm çapında ve yaklaşık 3 mm yüksekliğinde 30 yarım daire biçimli çıkıntıyı bastırın.
    NOT: Bir cam taşlama çubuğu kullanarak 30 yarım daire biçimli çıkıntıyı presleme işlemi, basınca dikkat edilerek yapılmalıdır çünkü çok sert bir pres plastiği delecek ve çıkarılan zehirsiz öğütme çubuğunu kirletecektir.
  2. Preslenmiş polietilen plastik filmi her iki tarafını 1 saat boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakarak dezenfekte edin.
  3. Yarım daire biçimli yüzeye az miktarda% 10 polivinil alkol ekleyin.

3. Trichogramma dendrolimi parazitizm

  1. CO2 anestezisinden sonra, T. dendrolimi dişi yaban arılarını bir toplama kutusuna koyun ve yaban arısı sayısı ~ 3000 idi.
  2. Film yumurta kartının dışbükey tarafını toplama kutusuna doğru yerleştirin ve kenarlarını bir lastik bantla sabitleyin.
  3. Her yarım daire biçimli çıkıntıya 4 μL amino asit çözeltisi (6 g/L lösin, 4 g/L fenilalanin, 4.25 g/L histidin) ekleyin. 16 cm uzunluğunda ve 12 cm genişliğinde düz bir polietilen plastik film ile örtün. Toplama kutusunu iki plastik tabakayla sıkıca kapatmak için bir lastik bant kullanın.
  4. T. dendrolimi yaban arılarının 4-8 saat boyunca serbestçe parazitlenmesine izin verin ve ıslatılmış pamuktan% 10 sakaroz suyu sağlayın.

4. T. dendrolimi zehirinin toplanması

  1. Yapay yumurta kartının iç çıkıntısından parazitlenmiş amino asit çözeltisini elde edin ve 1.5 mL'lik tüplerin kapağına aktarın.
  2. Tüp kapağını 25 mm çapında 10 μm naylon ağ ile kapatın, naylon ağı ve santrifüj tüpünü sıkıca sabitleyin. Santrifüj tüpünü 10 saniye boyunca bir mini santrifüj (1360 x g) kullanarak kısa santrifüjleme için dik olarak yerleştirin ve filtrelenmiş çözeltiyi (~100 μL T. dendrolimi zehiri) toplayın.
  3. Toplanan T. dendrolimi zehirinin konsantrasyonunu bir Bikinkoninik asit (BCA) tahlil kiti kullanarak ölçün (Malzeme Tablosu).
  4. Daha fazla analiz için zehri -80 °C'de saklayın.

5. SDS-PAGE analizleri

  1. 10 μL 4x sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) numune yükleme tamponuna (Malzeme Tablosu) 30 μL T. dendrolimi zehiri ekleyin ve 95 °C'de 10 dakika ısıtın.
  2. SDS-PAGE jeli 120 dakika boyunca 130 V'ta çalıştırın.
  3. Protein boyama aparatını (Malzeme Tablosu) kullanarak SDS-PAGE jelini boyayın ve rengini giderin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Temsili zehir örneklerinin protein konsantrasyonu, protein tahlil kiti kullanılarak ölçüldü ve sonuçlar Tablo 1'de sunuldu. Sonuçlar, bu yöntemle toplanan zehir proteini konsantrasyonunun 0.35 μg/μL ila 0.46 μg/μL arasında değiştiğini, amino asit çözeltisinin negatif kontrolünün ise sadece 0.03 μg/μL ila 0.05 μg/μL protein konsantrasyonuna sahip olduğunu gösterdi. Bu yöntemle toplanan zehir proteini konsantrasyonu, negatif kontrolden çok daha yüksektir, bu da bu yöntemin pa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, yapay konakçılar kullanarak T. dendrolimi'den zehir çıkarmak için bir yöntem sunuyoruz. Zehir toplama deneyinde kilit noktalar aşağıdaki gibidir. (1) Hazırlık sırasında, T. dendrolimi uygun bir CO2 konsantrasyonu ile hızlı bir şekilde uyuşturulmalıdır. CO2 konsantrasyonu çok düşükse, Trichogramma'yı hızlı bir şekilde uyuşturmak yetersiz olacaktır. Tersine, konsantrasyon çok yüksekse, Trichogramma ölebilir ve yapay konağı p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarın ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur ve rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Hainan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Hibe no. 323QN262), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Hibe no. 31701843 ve 32172483), Jiangsu Tarım Bilimi ve Teknoloji İnovasyon Fonu'ndan (Hibe No. CX (22) 3012 ve CX (21) 3008), Jiangsu Eyaleti "Shuangchuang Doktor" Vakfı (Hibe No. 202030472) ve Nanjing Ziraat Üniversitesi başlangıç fonu (Hibe No. 804018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 μm Nylon NetMilliporeNY1002500For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcoholAladdinP139533For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose waterSinopharm Chemical Reagent 10021463Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading bufferAce HardwareB23010301SDS-PAGE
Collection boxDeli8555Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells)Ace HardwareJ70236502XSDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatusGenScriptL00753SDS-PAGE
Glass grinding rod  Applygentb6268Semicircular protrudations 
L- LeucineSolarbioL0011Artificial host components
L-HistidineAladdinA2219458Artificial host components
L-PhenylalanineSolarbioP0010Artificial host components
Mini-CentrifugesScilogexD1008Centrifuge
MOPS-SDS running bufferAce HardwareB23021SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kitShanghai Yamay Biomedical Technology ZJ102For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holesThermo FisherAB1400LSemicircular protrudations 
Polyethylene plastic filmSuzhou Aopang Trading  001c5427Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa)YiFeiXue BiotechYWB007SDS-PAGE
Rubber bandGuangzhou qianrui biology science and technology009Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round holeSangon BiotechF504416-0001Semicircular protrudations 

Referanslar

  1. Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
  2. Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
  3. Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
  4. Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
  5. Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
  6. Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
  7. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
  8. Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568(1982).
  9. Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
  10. Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
  11. Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
  12. Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
  13. Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
  14. Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
  15. Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Zehir EkstraksiyonuParazitoid Yaban Ar sTrichogramma DendrolimiYapay KonakBiyokontrolHa ere KontrolZehirli HayvanlarBiyoaktif Molek llerT pZehir ToplamaZehir Toplamada Kar la lan ZorluklarTrichogramma Yaban Ar larBiyolojik M cadeleLepidopteran Zararl larPolietilen FilmAmino Asit zeltileriYapay Konak larKontaminasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır