İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Özet

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

Özet

Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin çok önemli bir bölümünü oluşturan miyeloid soy hücreleridir. Son on yılda, nötrofillerin, antimikrobiyal savunmada çok önemli yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu da dahil olmak üzere çoklu mekanizmalar yoluyla immün düzensizliğin başlatılmasına ve sürdürülmesine katkıda bulunarak kanser, otoimmün hastalıklar ve çeşitli akut ve kronik inflamatuar durumların patogenezinde oynadığı ek kilit roller ortaya çıkmıştır. NET oluşumunu tarafsız, tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde ölçme tekniklerindeki sınırlamalar, nötrofillerin sağlık ve hastalıklardaki rolünü daha iyi anlama yeteneğimizi kısıtlamıştır. Hücre içi ve hücre dışı DNA'yı görüntülemek için iki farklı DNA boyası kullanan bir membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımı ile birleştirilmiş bir canlı hücre görüntüleme platformu kullanarak NET oluşumuna uğrayan nötrofillerin miktarını belirlemek için otomatik, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Bu metodoloji, nötrofil fizyolojisinin değerlendirilmesine ve NET oluşumunu hedefleyebilen moleküllerin test edilmesine yardımcı olabilir.

Giriş

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), çeşitli enflamatuar uyaranlara yanıt olarak nötrofillerden ekstrüde edilen ağ benzeri kromatin yapılardır. NET'ler, enfeksiyöz patojenleri yakalayan ve öldüren ve inflamatuar yanıtları tetikleyen DNA, histonlar ve çeşitli anti-mikrobiyal proteinler/peptitlerden oluşur¹.

NET'ler patojenlere karşı konak savunması için faydalı olmakla birlikte, çeşitli otoimmün hastalıkların², tromboz³, metabolik hastalıkların⁴ ve kanserlerin metastatik büyümesinin⁵ potansiyel bir itici gücü olarak dikk....

Protokol

Sağlıklı insan deneklerden alınan nötrofiller, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokol kapsamında bilgilendirilmiş onam verildikten sonra elde edildi. Protokol, NIH insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Nötrofillerin boyanması ve test plağının hazırlanması

1. Her enstitünün kılavuzunu izleyerek uygun yazılı bilgilendirilmiş onam ile periferik kan alın ve istenen herhangi bir yöntemi kullanarak nötrofilleri izole edin. Örneğin, Ficoll-dekstran yöntemi^10,11, nötrofillerin insan periferik kanında....

Tartışmalar

NET'leri ex vivo ölçmek için mevcut yöntemlerin, nötrofilleri, NET'leri ve potansiyel terapötik hedefleri tarafsız ve yüksek verimli bir şekilde inceleme yeteneğimizi sınırlayan çeşitli dezavantajları vardır^10,14. Örneğin, NET'lerin miktar tayini için altın standart olarak kabul edilen immünofloresan boyamadan sonra NET oluşturan hücrelerin doğrudan sayımı düşük verimlidir ve operatörün öznel görüşüne bağlıdır. Memb.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.