Benign Gastrik Vücut ve Antral Epitel Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Gastrik Organoidlerin Oluşturulması ve Karakterizasyonu

Özet

Mide hastası kaynaklı organoidler araştırmalarda giderek artan bir kullanım alanı bulmaktadır, ancak standartlaştırılmış tohumlama yoğunluğuna sahip tek hücreli sindirimlerden insan mide organoidleri üretmek için resmi protokoller eksiktir. Bu protokol, üst endoskopi sırasında elde edilen biyopsi dokusundan gastrik organoidlerin güvenilir bir şekilde oluşturulması için ayrıntılı bir yöntem sunar.

Özet

Mide hastası kaynaklı organoidler (PDO'lar), mide biyolojisi ve patolojisini incelemek için benzersiz bir araç sunar. Sonuç olarak, bu PDO'lar çok çeşitli araştırma uygulamalarında artan bir kullanım alanı bulmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış bir başlangıç hücre tohumlama yoğunluğunu korurken, tek hücreli sindirimlerden gastrik PDO'lar üretmek için yayınlanmış yaklaşımların eksikliği vardır. Bu protokolde, izole edilmiş tek hücrelerden mide organoidlerinin başlatılması ve organoidlerin parçalanma yoluyla geçirilmesi için bir yöntemin sağlanması üzerinde durulmaktadır. Daha da önemlisi, protokol, ilk hücre tohumlama yoğunluğuna standartlaştırılmış bir yaklaşımın, iyi huylu biyopsi dokusundan tutarlı bir şekilde gastrik organoidler verdiğini ve organoid büyümesinin standartlaştırılmış nicelleştirilmesine izin verdiğini göstermektedir. Son olarak, kanıtlar, gastrik PDO'ların, organoidlerin vücudun biyopsilerinden mi yoksa midenin antral bölgelerinden mi kaynaklandığına bağlı olarak değişen oluşum ve büyüme oranları gösterdiğine dair yeni gözlemi desteklemektedir. Spesifik olarak, organoid başlatma için antral biyopsi dokusunun kullanılmasının, mide gövdesinin biyopsilerinden üretilen organoidlere kıyasla 20 günlük bir süre boyunca daha fazla sayıda organoid oluşumu ve daha hızlı organoid büyümesi ile sonuçlandığı ortaya konmuştur. Burada açıklanan protokol, araştırmacılara gastrik PDO'ları başarılı bir şekilde oluşturmak ve bunlarla çalışmak için zamanında ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.

Giriş

Organoidler, türetildikleri organların mimarisine ve işlevselliğine benzeyen minyatür üç boyutlu (3D) hücresel yapılardır ^1,2. Laboratuvarda yetiştirilen bu modeller, kök hücrelerin veya dokuya özgü hücrelerin, bu hücrelerin kendi kendini organize etmesine ve çeşitli hücre tiplerine farklılaşmasına izin veren kontrollü bir ortamda yetiştirilmesiyle oluşturulur ^1,2,3. Organoidlerin en önemli avantajlarından biri, insan biyolojisini geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürlerinden^daha yakından öz....

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm insan dokusu, Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #842961) tarafından onaylanan bir mide dokusu toplama çalışması yoluyla doku toplanması için bilgilendirilmiş onam veren kişilerden toplanmıştır. Bu çalışmaya katılanların rutin bakımlarının bir parçası olarak üst endoskopi yaptırmaları, en az 18 yaşında olmaları ve bilgilendirilmiş onam verebilmeleri gerekiyordu. Yapılan tüm araştırmalar, Pennsylvania Üniversitesi tarafından belirlenen yönergelere bağlı kalmıştır.

1. Deneysel hazırlık

1. Şartlandırılmış L-WRN ortamını daha önce açıklandığı gibi hazırlayın

Tartışmalar

Burada, mide gövdesinden ve antrumdan iyi huylu epitel biyopsilerinden izole edilen tek hücrelerden insan mide organoidlerini güvenilir bir şekilde üretmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Protokoldeki kritik adımlar, bazal membran matrisinin ele alınmasının yanı sıra zamanlama etrafında döner. Canlılığı korumak için, biyopsi dokusunu aldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede protokolü başlatmak önemlidir. Amaç, biyopsi yapıldıktan sonraki 30 dakika içinde biyopsi dokusunun s.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503