İn Vitro Periferik Sinir Rejenerasyonu için Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı ile Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi

Özet

Burada, Schwann hücrelerini in vitro olarak uyarmak için nanosaniye darbeli elektrik alanı (nsPEF) uygulamak için bir protokol sunuyoruz. İlgili faktörlerin ve hücre davranışı değişikliklerinin sentezi ve salgılanma yeteneği, nsPOF kullanılarak başarılı stimülasyonu doğruladı. Çalışma, periferik sinir rejenerasyon yönteminin olumlu bir görünümünü vermektedir.

Özet

Schwann hücreleri (SK'ler), periferik sinir sisteminin miyelinli hücreleridir ve periferik sinir rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynarlar. Nanosaniye Darbe Elektrik Alanı (nsPEF), hücre proliferasyonunu ve diğer biyolojik süreçleri uyarmada etkili olduğu gösterilmiş, sinir elektriksel stimülasyonunda uygulanabilir yeni ortaya çıkan bir yöntemdir. SK'lerin nsPEF altında önemli değişikliklere uğrayıp uğramadığını değerlendirmek ve yeni periferik sinir rejenerasyon yöntemlerinin potansiyelini keşfetmeye yardımcı olmak amacıyla, kültürlenmiş RSC96 hücreleri 5 kV ve 10 kV'de nsPEF stimülasyonuna tabi tutuldu ve ardından 3-4 gün boyunca ekintiye devam edildi. Daha sonra, spesifik belirteç proteini, nörotrofik faktör, transkripsiyon faktörü ve miyelinasyon regülatörü dahil olmak üzere başarılı stimülasyonu göstermek için SK'ler tarafından ifade edilen bazı ilgili faktörler değerlendirildi. Temsili sonuçlar, nsPEF'in SK'lerin proliferasyonunu ve göçünü ve periferik sinirlerin rejenerasyonuna olumlu katkıda bulunan ilgili faktörleri sentezleme yeteneğini önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Aynı zamanda, GFAP'ın daha düşük ekspresyonu periferik sinir yaralanmalarının benign prognozunu gösterdi. Tüm bu sonuçlar, nsPEF'in SK'leri uyararak periferik sinir yaralanmaları için etkili bir tedavi yöntemi olarak büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Giriş

Her yıl milyonlarca insan hem periferik sinir sistemini (PNS) hem de merkezi sinir sistemini (CNS) içeren sinir yaralanmalarından ^{etkilenmektedir1}. Çalışmalar, sinir yaralanmalarından sonra CNS'nin aksonal onarım kapasitesinin oldukça sınırlı olduğunu, PNS'nin ise SC'lerin^2'nin önemli plastisitesi nedeniyle artmış kapasite gösterdiğini göstermiştir. Bununla birlikte, periferik sinir yaralanmalarından sonra tam rejenerasyonun sağlanması zorlu olmaya devam etmekte ve insan sağlığı için önemli bir zorluk teşkil etmeye devam etmektedir ^3,4. Günümüzde, otogreftler, do....

Protokol

1. Dondurularak saklanmış RSC96 hücrelerinin çözülmesi

1. 1 mL hücre süspansiyonu içeren kriyoviyalı 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çalkalayarak çözün ve ardından 4-6 mL tam kültür ortamı içeren bir santrifüj tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın.
2. 3-5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 3 mL tam kültür ortamında yeniden süspanse edin.
3. Hücre süspansiyonunu 6-8 mL tam kültür ortamı içeren bir kültür şişesine (veya kabına) ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Ertesi gün, mikroskop altında hücre büyümesini ve yoğunluğunu gözlemleyin.

Tartışmalar

Son yıllarda, bildirildiği gibi, nsPEF uygulaması artan bir büyüme yaşadı. nsPEF, yalnızca istenen alan üzerinde yüksek oranda hedeflenmiş bir etkiye sahiptir, ek termal hasara neden olmadan tedavi etmek için yeterli enerji sağlar ve insan vücudu için daha güvenli hale getirir²⁸. Bu özellikler, tümör tedavisinde ve sinir rejenerasyonunda umut verici translasyonel beklentiler sağlar. Bununla birlikte, bazı çalışmalar nsPEF'in bazı sınırlamalarını önermiştir. Malzeme a.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100