Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Özet

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Özet

Stomalar, bitki yaprağı epidermisinde bulunan mikroskobik gözeneklerdir. Stoma açıklığının düzenlenmesi sadece fotosentez ve transpirasyonel su kaybı için karbondioksit alımını dengelemek için değil, aynı zamanda bakteri istilasını kısıtlamak için de çok önemlidir. Bitkiler mikropların tanınması üzerine stomaları kapatırken, Pseudomonas syringae pv gibi patojenik bakteriler. domates DC3000 (Pto), yaprağın iç kısmına erişmek için kapalı stomaları yeniden açın. Bakteri istilasına stoma tepkilerini değerlendirmek için yapılan geleneksel tahlillerde, yaprak epidermal kabukları, yaprak diskleri veya müstakil yapraklar bakteri süspansiyonu üzerinde yüzdürülür ve daha sonra stomalar mikroskop altında gözlemlenir ve ardından stoma açıklığının manuel ölçümü yapılır. Bununla birlikte, bu tahliller zahmetlidir ve bitkiye bağlı bir yaprakta doğal bakteri istilasına stoma tepkilerini yansıtmayabilir. Son zamanlarda, bir yaprağı bitkiden ayırmadan sıkıştırarak stomaları gözlemleyebilen taşınabilir bir görüntüleme cihazı ve cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntülerinden stoma açıklığını otomatik olarak ölçmek için tasarlanmış derin öğrenme tabanlı bir görüntü analizi boru hattı geliştirildi. Burada, bu teknik ilerlemelere dayanarak, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına stoma yanıtlarını değerlendirmek için yeni bir yöntem tanıtıldı. Bu yöntem üç basit adımdan oluşur: doğal enfeksiyon süreçlerini taklit eden Pto'nun sprey aşılanması, taşınabilir görüntüleme cihazı kullanılarak Pto aşılanmış bitkinin bir yaprağındaki stomaların doğrudan gözlemlenmesi ve görüntü analizi boru hattı ile stoma açıklığının otomatik ölçümü. Bu yöntem, doğal bitki-bakteri etkileşimini yakından taklit eden koşullar altında Pto istilası sırasında stoma kapanmasını ve yeniden açılmasını göstermek için başarıyla kullanılmıştır.

Giriş

Stomalar, yaprakların yüzeyinde ve bitkilerin diğer hava kısımlarında bir çift koruyucu hücre ile çevrili mikroskobik gözeneklerdir. Sürekli değişen ortamlarda, stoma açıklığının düzenlenmesi, bitkilerin terleme yoluyla su kaybı pahasına fotosentez için gerekli olan karbondioksit alımını kontrol etmeleri için çok önemlidir. Bu nedenle, stoma açıklığının nicelleştirilmesi, bitki çevresel adaptasyonunu anlamada etkili olmuştur. Bununla birlikte, stoma açıklığının ölçülmesi, mikroskopla yakalanan bir yaprak görüntüsündeki stoma gözeneklerini tespit etmek ve ölçmek için insan emeği gerektirdiğinden, doğası gereği zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu sınırlamaları aşmak için, st....

Protokol

1. Büyüyen bitkiler

1. Dormansi kırılması için, A. thaliana (Col-0) tohumlarını deiyonize suda tekrar süspanse edin ve karanlıkta 4 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
2. Tohumları toprağa ekin ve beyaz floresan ışıkla donatılmış bir odada büyütün. Aşağıdaki büyüme koşullarını koruyun: 22 °C sıcaklık, 10 saat boyunca 6.000 lux (yaklaşık 100 μmol/^m2/s) ışık yoğunluğu ve %60 bağıl nem.
3. Gerektiğinde bitkileri sıvı gübre ile sulayın. Aşılamadan 1 hafta ila 2 gün önce sulamadan kaçının ve aşılamadan 1 gün önce iyice sulayın.

2. Bakteri aşısının hazırlanması

<....

Tartışmalar

Önceki çalışmalar, bakteri istilalarına^stoma tepkilerini araştırmak için epidermal kabuklar, yaprak diskleri veya müstakil yapraklar kullandı ^9,11,12. Buna karşılık, bu çalışmada önerilen yöntem, Pto'nun sprey aşılanmasından sonra bitkiye bağlı bir yaprak üzerindeki stomaları doğrudan gözlemlemek için taşınabilir stoma görüntüleme cihazından yararlanır ve bakteri istilasının doğal k.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron