Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Özet

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Özet

Kalsiyum sinyali, hemen hemen her dokunun ayrılmaz bir düzenleyicisidir. Bağırsak epiteli içinde kalsiyum, salgı aktivitesinin, aktin dinamiklerinin, inflamatuar yanıtların, kök hücre proliferasyonunun ve diğer birçok karakterize edilmemiş hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyal dinamiklerinin haritalanması, homeostatik hücresel süreçler hakkında fikir verebilir ve çeşitli uyaranlara benzersiz tepkileri ortaya çıkarabilir. İnsan bağırsak organoidleri (HIO'lar), bağırsak epitelini incelemek için yüksek verimli, insan kaynaklı bir modeldir ve bu nedenle kalsiyum dinamiklerini araştırmak için yararlı bir sistemi temsil eder. Bu makale, HIO'ları genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ile kararlı bir şekilde dönüştürmek, canlı floresan mikroskobu gerçekleştirmek ve kalsiyum sinyallerini anlamlı bir şekilde karakterize etmek için görüntüleme verilerini analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Temsili bir örnek olarak, 3 boyutlu HIO'lar, yeşil floresan protein bazlı sitozolik bir GECI olan GCaMP6'ları stabil bir şekilde eksprese etmek için lentivirüs ile dönüştürüldü. Tasarlanan HIO'lar daha sonra tek hücreli bir süspansiyona dağıtıldı ve tek katmanlar olarak tohumlandı. Farklılaşmadan sonra, HIO tek tabakaları rotavirüs ile enfekte edildi ve/veya kalsiyum yanıtını uyardığı bilinen ilaçlarla tedavi edildi. Sıcaklık kontrollü, nemlendirilmiş canlı görüntüleme odası ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu, enfekte olmuş veya ilaçla tedavi edilmiş tek tabakaların uzun süreli görüntülenmesine izin verdi. Görüntülemenin ardından, elde edilen görüntüler ücretsiz olarak kullanılabilen analiz yazılımı ImageJ kullanılarak analiz edildi. Genel olarak, bu çalışma HIO'larda hücresel sinyallemeyi karakterize etmek için uyarlanabilir bir boru hattı oluşturur.

Giriş

Kalsiyum, hücresel fizyolojinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynayan, yaygın olarak korunan ikinci bir habercidir¹. Güçlü yükü, küçük boyutu ve fizyolojik koşullarda yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, kalsiyum, protein konformasyonunun ideal bir manipülatörüdür. Bu, kalsiyumu elektrokimyasal sinyalleri enzimatik, transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrası değişikliklere dönüştürmek için güçlü bir araç haline getirir. Endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membranları boyunca katı kalsiyum konsantrasyonu gradyanları, sitozolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı değişikliklere izin veren yüksek bir itici güç oluşturur. Hem arabelleğe alma ....

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm insan bağırsak organoidleri (HIO'lar) ve temsili deneyler, Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Enteroid Çekirdeği tarafından elde edilen ve sürdürülen insan dokusundan türetilmiştir. Tüm örnekler, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak toplandı.

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması

1. Organoid bakımı için, hücre kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu plakalar, bazal membran matrisi (BMM), 15 mL konik tüpler ve 1.5 mL konik tüpler toplayın.
   1. Büyüme faktörleri (CMGF-) olmadan tam ortam hazırlamak için, 500 mL geli....

Tartışmalar

Sitozolik Ca²⁺ seviyelerindeki değişiklikler,^{epitel 10,16,17} içindeki patolojilerin hem nedeni hem de sonucu olabilir. Sitozolik kalsiyumdaki artışlar, kalsiyuma bağımlı klorür kanalının aktivasyonu yoluyla doğrudan sekresyona neden olabilir^{TMEM16A 18,19}. Ca2⁺'ya yanıt olarak TMEM16A aktivasyonu, apikal klorür akışına izin vererek, .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254