Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu Makalede
Özet
Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.
Özet
Tümör mikroçevresi, konakçı hücreler, tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri, stromal hücreler ve vaskülatür arasındaki etkileşimleri içerir. İmmün hücre alt kümelerinin ve hedef proteinlerin karakterize edilmesi ve uzamsal olarak düzenlenmesi prognostik ve terapötik amaçlar için çok önemlidir. Bu durum çoğullanmış immünohistokimya boyama yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Multipleks floresan immünohistokimyası, hücre fonksiyonunun ve hücreler arası etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırarak çoklu belirteçlerin aynı anda saptanmasına izin verir. Bu yazıda, multipleks siklik floresan immünohistokimya testi için bir iş akışı ve lenfosit alt kümelerinin kantitifikasyon analizinde uygulanması açıklanmaktadır. Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama, antijen alımı, siklik antikor inkübasyonu ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) bir doku lamı üzerinde boyamayı içeren standart immünohistokimya ile benzer adımları ve reaktifleri takip eder. Antijen-antikor reaksiyonu sırasında, farklı türlerden bir antikor karışımı hazırlanır. Antijen alma süresi ve antikor konsantrasyonu gibi koşullar, sinyal-gürültü oranını artırmak için optimize edilir ve doğrulanır. Bu teknik tekrarlanabilir ve immünoterapi araştırmaları ve klinik uygulamalar için değerli bir araç olarak hizmet eder.
Giriş
Beyin metastazları (BM), küçük hücreli dışı akciğer kanseri vakalarının (KHDAK) yaklaşık yarısında meydana gelen ve kötü prognozlu en yaygın merkezi sinir sistemi (MSS) tümörlerini temsil eder1. KHDAK hastalarının tahminen %10-20'si ilk tanı sırasında zaten BM'ye sahiptir ve KHDAK vakalarının yaklaşık %40'ında tedavi sırasında KHDAK gelişecektir2. Tümör mikroçevresi (TME), kan damarları, fibroblastlar, makrofajlar, hücre dışı matriks (ECM), lenfoid, kemik iliği kaynaklı bağışıklık hücreleri ve sinyal molekülleri gibi çeşitli bileşenler dahil olmak üzere NSCLC oluşumu ve BM ile yakından ilişkilidir....
Protokol
Araştırma, Yunnan Kanser Hastanesi / Kunming Tıp Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi tıbbi etik komitesi tarafından onaylandı. Tüm denekler/yasal vasiler bilgilendirilmiş onam imzaladı.
1. Slayt hazırlama
- Primer akciğer tümörü veya akciğer kanseri beyin metastazı hücrelerini içeren eşleştirilmiş parafin bloklarının bölümlerini bir mikrotom kullanarak 4 μm kalınlığında kesin. Bölümleri suya çıkarın ve cımbızla ayırın, en iyisini seçin ve polilisin kaplı slayta yapıştırın.
- Doku yapışmasını artırmak için doku slaytlarını 65 °C'de 30 dakika fırına koyun.
- Slaytları, her biri 10 dakika süren üç değiş....
Temsili Sonuçlar
Tek bir slayt üzerinde 5 renkli multipleks floresan kullanarak döngüsel antijen tespiti için bir protokol sunuyoruz. Tahlili optimize ederek, farklı türlerden iki antikorun inkübasyonunu sağlıyoruz (Şekil 1). Deney prosedürü için gerekli cihazlar arasında bir düdüklü tencere ve immün boyama kutusu bulunur (Şekil 2A).
Testi tamamladıktan sonra, slaytları taramadan önce dört işaretleyicinin sahte rengini tanımla.......
Tartışmalar
Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama sürecini tanımladık. Primer antikor seçimi, floresan immünohistokimya testinin çok önemli bir yönüdür ve daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik için monoklonal antikorlar önerilir. Primer antikorun çalışma konsantrasyonunu optimize etmek için, immünohistokimya deneyleri yoluyla bir dizi seyreltme test edilmiştir. Hem pozitif kontroller (hedef antijen ekspresyonunu değerlendirmek için) hem de negatif kontroller (primer antikor inkübasyonu yok) es.......
Açıklamalar
Yazarlar, bu yazıda bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NO.81860413, 81960455), Yunnan Bilim ve Teknoloji Departmanı Fonu (202001AY070001-080), Yunnan Eyaleti Eğitim Departmanı Bilimsel Araştırma Vakfı (2019J1274) tarafından desteklenmiştir.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
Referanslar
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır