Jiawei Shengjiang San'ın Diyabetik Nefropatinin Sıçan Modeli Üzerindeki Antagonistik Etkisi: EGFR / MAPK3 / 1 Sinyal Yolu ile İlgili

Özet

Burada, diyabetik nefropati tedavisinde Jiawei Shengjiang San'ın (JWSJS) etki mekanizmasını keşfetmek için ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme tekniklerini tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Jiawei Shengjiang San'ın (JWSJS) diyabetik nefropati tedavisinde ve ağ farmakolojisini dağıtma eylemini destekleyen mekanizmaları araştırmayı amaçladık. Ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme tekniklerini kullanarak, JWSJS'nin aktif bileşenlerini ve hedeflerini tahmin ettik ve titiz bir "ilaç-bileşen-hedef" ağı oluşturduk. JWSJS'nin terapötik yolaklarını ve hedeflerini ayırt etmek için gen ontolojisi (GO) ve Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri kullanıldı. Moleküler yerleştirme doğrulaması için Autodock Vina 1.2.0 konuşlandırıldı ve yerleştirme sonuçlarını doğrulamak için 100 ns'lik bir moleküler dinamik simülasyonu gerçekleştirildi, ardından in vivo hayvan doğrulaması yapıldı. Bulgular, JWSJS'nin diyabetik nefropati ile kesişen 227 hedefi paylaştığını ve bir protein-protein etkileşim ağı topolojisi oluşturduğunu ortaya koydu. KEGG zenginleştirme analizi, JWSJS'nin lipidleri ve aterosklerozu, PI3K-Akt sinyal yolağını, apoptozu ve HIF-1 sinyal yolunu modüle ederek diyabetik nefropatiyi hafiflettiğini, mitojenle aktive olan protein kinaz 1 (MAPK1), MAPK3, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve serin / treonin-protein kinaz 1 (AKT1) ile çoklu yolların toplu hedefleri olarak tanımlandı. Moleküler yerleştirme, JWSJS'nin temel bileşenlerinin (quercetin, palmitoleik asit ve luteolin), hidrojen bağı yoluyla üç önemli hedefle (MAPK1, MAPK3 ve EGFR) konformasyonu stabilize edebileceğini iddia etti. İn vivo incelemeler, JWSJS'ye bağlı olarak vücut ağırlığında kayda değer bir artış ve glikasyonlu serum proteini (GSP), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C), üridin trifosfat (UTP) ve açlık kan şekeri (FBG) seviyelerinde azalma olduğunu gösterdi. Hematoksilen ve eozin (HE) ve Periyodik asit-Schiff (PAS) boyama ile birleştirilmiş elektron mikroskobu, her tedavi grubunun böbrek hasarını çeşitli derecelerde hafifletme potansiyelini vurguladı, p-EGFR, p-MAPK3 / 1 ve BAX'ta çeşitli düşüşler sergiledi ve tedavi edilen sıçanların böbrek dokularında BCL-2 ekspresyonunda artışlar. Sonuç olarak, bu içgörüler, JWSJS'nin diyabetik nefropati üzerindeki koruyucu etkinliğinin, EGFR / MAPK3 / 1 sinyal yolunun aktivasyonunu baskılamak ve renal hücre apoptozunu hafifletmek ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Diabetes mellitus (DM), diyabetik nefropati (DN), retinopati ve nöropati gibi sürekli hiperglisemiye bağlı çeşitli komplikasyonlara neden olabilen ve birden fazla sistemi etkileyen kronik bir hastalıktır¹. DN, DM'nin ciddi bir komplikasyonudur ve son dönem böbrek yetmezliğinin (SDBY^{) yaklaşık} %30-50'sini oluşturur2. Klinik belirtisi, artmış glomerüler hacim, mezanjiyal stromal hiperplazi ve kalınlaşmış glomerüler bazal membran³ ile karakterize SDBY'ye ilerleyebilen mikroalbüminüridir. DN'nin patogenezi karmaşıktır ve tam olarak aydınlatılamamıştır. Kan şekerini düşürmek, kan basıncını düzenlemek, proteinüriyi azaltmak gibi klinik yöntemler çoğunlukla ilerlemesini geciktirmek için kullanılır ancak etkisi geneldir.

Şu anda, DN^4'ü tedavi etmek için spesifik bir ilaç bulunamamıştır. Bununla birlikte, yüzyıllar boyunca, Çin bitkisel ilaçları DM ve komplikasyonlarının^{tedavisinde yaygın} olarak kullanılmaktadır 5 ve hastaların klinik semptomlarını iyileştirmiş ve hastalığın ilerlemesini geciktirmiştir. Çok bileşenli, çok hedefli ve çok yolaklı etkilerin avantajları nedeniyle, Çin bitkisel ilaçlarının DN⁶ tedavisi için yenilikçi bir ilaç kaynağı olması beklenmektedir.

"Shengjiang san", Ming Hanedanlığı tıp doktoru Gong Tingxian tarafından "Wanbing Huichun" dan gelmektedir. "Neifu Xianfang" kitabı, Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma ve Radix Rhei et Rhizome'un kullanımını açıklar. Buna dayanarak, Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba ve Smilacis Glabrae Rhixoma'yı ekledikten sonra, shengjiang san'ın berraklığı artırma, bulanıklığı azaltma, durgun "ısıyı" serbest bırakma ve "qi" ile kanı uyumlu hale getirme işlevini yerine getirir ^7,8. Ayrıca dalağı güçlendirme ve böbrekleri tonlama etkisini arttırır. Etkinliği, DN'nin "qi" nin "hayati enerji" eksikliği, aşırı kuruluk ve "ısı" ve üçlü bir enerji vericinin neden olduğu "ısı" durgunluğu nedeniyle düzensiz yükselmesi ve düşmesi patogenezi ile tutarlıdır ^7,8.

Önceki klinik çalışmalar, Çin bitkisel ilaçlarının DM ve komplikasyonlarını tedavi etmek için kullanıldığını göstermiştir ve jiawei shengjiang san'ın (JWSJS) kan şekerini ve lipitleri düzenlediği, proteinüriyi azalttığı ve erken DN^7'li hastaların klinik etkinliğini önemli ölçüde iyileştirdiği gösterilmiştir. JWSJS'nin DN sıçanlarında idrar proteini ve kan şekeri düzeylerini düşürme yeteneği önceki çalışmalarla doğrulanmıştır. Bu muhtemelen TXNIP/NLRP3 ve RIP1/RIP3/MLKL sinyal yolaklarını inhibe ederek, podosit piroptozunu azaltarak ve DN sıçanlarının böbrek dokularında nekrotik apoptozu önleyerek ve böylece böbrek koruması^{sağlayarak gerçekleşir 9}. JWSJS, DN sıçanlarında nefrin ve podosin protein ekspresyonunu yukarı regüle edebilir ve podosit hasarını azaltabilir, böylece JWSJS'nin podosit hasarı üzerinde inhibe edici bir etkiye sahip olduğunu düşündürür. JWSJS, iyi güvenlik profillerine sahip belirli bir anti-DN etkisine sahiptir, ancak bu konuda çok az araştırma vardır ve bu çalışma çoğunlukla piroptoz ve nekrotik apoptoz üzerine odaklanmaktadır. Literatür yeterince derin veya sistematik değildir¹⁰. Önceki bulgularımız, JWSJS'nin DN sıçanlarında^{proteinüriyi} azaltabileceğini ve böbrek hasarını hafifletebileceğini doğrulamıştır 7. Bununla birlikte, DN tedavisi için JWSJS'nin mekanizması hakkında sadece birkaç çalışma vardır ve bunlar derinlik ve sistematizasyondan yoksundur. Bu nedenle, bu çalışma, ağ farmakolojisi kullanarak DN tedavisi için JWSJS'nin moleküler maddelerini ve etki mekanizmalarını analiz etmeyi ve gelecekteki araştırmalar için sağlam bir temel sağlamayı amaçlamaktadır.

Ağ farmakolojisi, keminformatik, ağ biyolojisi, biyoinformatik ve farmakoloji dahil olmak üzere ilaç etki mekanizmasını incelemek için ortaya çıkan bir yöntemdir ^11,12. Ağ farmakolojisi araştırma tasarımı, geleneksel Çin tıbbının bütünsel kavramına^{oldukça benzer 13,14} ve Çin bitkisel ilaçlarının mekanizmasını incelemek için önemli bir yöntemdir. Moleküler kenetlenme, moleküller arasındaki etkileşimleri inceleyebilir ve bağlanma modellerini ve afinitelerini tahmin edebilir. Moleküler yerleştirme, bilgisayar destekli ilaç araştırmaları alanında kritik bir teknik olarak ortaya çıkmıştır¹⁵. Bu nedenle, bu çalışma, JWSJS ile DN tedavisinin daha fazla araştırılması için güvenilir ve teorik bir temel sunan ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme yöntemleri aracılığıyla bir JWSJS-DN-hedef etkileşim ağı oluşturmuştur.

Protokol

Tüm hayvanlar, ABD Ulusal Araştırma Konseyi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, 8. Baskı'ya uygun olarak korunmuş ve kullanılmış ve ARRIVE kılavuzlarında^16,17 önerildiği şekilde rapor edilmiştir. Çalışma, Çin Ulusal Araştırma Konseyi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütüldü ve Hebei Çin Tıbbı Üniversitesi (DWLL2019030) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. JWSJS aktif bileşenleri ve hedef toplama

1. Tüm kimyasal bileşenleri almak için geleneksel Çin tıbbı sistemleri farmakoloji veritabanı ve analiz platformu (TCMSP) veritabanına¹⁸ tıbbi bileşim JWSJS'yi (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome ve Curcumaelongae Rhizoma) girin.   Absorpsiyon, dağılım, metabolizma ve boşaltım (ADME) ekranına göre oral biyoyararlanım (OB≥) %30 ve ilaç benzeri özelliklere (DL) göre ≥ 0.18 kimyasal bileşen^19,20.
2. Kimyasal bileşenlerin karşılık gelen hedeflerini almak için TCMSP veritabanını (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, Sürüm 2.3) kullanın.
3. Geleneksel Çin Tıbbı ve Kimyasal Bileşim veritabanlarında arama yaparak Bombyx Batryticatus ve Cicadae Periostracum'un aktif bileşenlerini elde edin²¹.
4. Deneysel güvenilirlik için, bu çalışma için kimyasal özet servisi (CAS) numaralarına sahip bileşikleri seçin. Ardından PubChem'den (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, 2021'de güncellendi)²² aktif bileşenlerin 2B yapı diyagramlarını (.sdf formatı) indirin.
5. İlaç benzerliği olarak gastrointestinal (GI) absorpsiyonu yüksek olan bileşenleri (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) taramak için SwissADME (www.swissadme.ch, 2021'de güncellendi)²³kullanın ve ≥ 2 maddesi 'Evet' idi. Bu, Bombyx Batryticatus ve Cicadae Periostracum'un aktif bileşenlerine yol açtı.
6. Hedef protein tahmini için bunları TCMSP veritabanına aktarın (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Sürüm 2.3)¹⁸.
7. UniProt veritabanındaki (https://www.uniprot.org, 2021'de güncellendi) hedefleri, durumu İncelendi ve türler İnsan²⁴ olarak ayarlanarak standartlaştırın.

2. DN'ye karşılık gelen hedef koleksiyon

1. GeneCards (https://www.genecards.org/, Sürüm. 5.1)²⁵, OMIM (https://omim.org/, 2021'de güncellendi)²⁶, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, 2021'de güncellendi)²⁷, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, 2021'de güncellendi)²⁸ ve DrugBank veritabanları (https://www.drugbank.ca/, 2021'de güncellendi)²⁹. Birleştirdikten ve tekilleştirdikten sonra DN hedeflerini elde edin.
2. JWSJS ve DN'nin ortak hedeflerinin taranması ve ağ inşası
   1. R 4.2.0 yazılımını kullanarak JWSJS ve DN'nin ortak hedeflerini tarayın ve Venn diyagramları çizin. İlaçlar, bileşenler, hedefler ve hastalıklar arasındaki bağlantıyı görselleştiren bir İlaç-Bileşen-Hedef ağ diyagramı oluşturmak için JWSJS'nin aktif bileşenlerini ve potansiyel hedeflerini Cytoscape 3.8.0 yazılımına³⁰ aktarın.
   2. Düğümün boyutunun derece değerinin boyutunu yansıtmasına izin verin, burada daha yüksek bir derece değeri düğümün ağda daha önemli olduğunu gösterir.
3. PPI protein-protein etkileşim ağının oluşturulması ve temel hedeflerin taranması
   1. Bir protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturmak için çevrimiçi platform STRING'i (Sürüm:11.5) kullanarak kesişen genleri analiz edin³¹. Çoklu Protein analiz modunu kullanarak ağı oluşturun, türü Homo sapiens olarak ayarlayın ve gereken minimum etkileşim puanını >0.9³⁰ olarak ayarlayın.
   2. Cytoscape 3.8.0'ı kullanarak ağı topolojik olarak analiz edin, aradaki merkezilik (BC), yakınlık merkeziliği (CC), derece merkeziliği (DC), Özvektör merkeziliği (EC), yerel ortalama bağlantı tabanlı yöntem (LAC) ve her düğüm için ağ merkeziliği (NC) değerlerini hesaplayın ve tüm değerleri medyan^32'den büyük olan altı düğümü süzün. DN tedavisi için JWSJS'nin temel hedeflerini belirlemek için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
4. GO fonksiyonel analizleri ve KEGG yolu zenginleştirme analizi
   1. JWSJS ve DN'nin ortak hedefleriyle ilişkili biyolojik süreçleri, moleküler fonksiyonları, hücresel bileşenleri ve yolları belirlemek için GO ve KEGG zenginleştirme analizleri gerçekleştirin.
   2. Kuruluşu kullanın . Kesişim hedeflerinin kimliklerini almak için Hs.eg.db paketi açın ve clusterProfiler, org'u kullanın. Zenginleştirme analizleri için Hs.eg.db, Enrichplot ve Ggplot2 paketleri³³.
   3. Düzeltilmiş P

3. Moleküler yerleştirme

1. JWSJS çekirdek bileşenleri ile DN tedavisi³⁴ için temel hedefler arasında moleküler yerleştirme gerçekleştirmek için AutoDock Vina yazılımını kullanın.
2. JWSJS çekirdek bileşenlerinin 2B yapısının sdf dosyasını elde etmek için PubChem veritabanında arama yapın. 3D yapısını oluşturmak ve optimize etmek için ChemBio 3D Ultra14.0 yazılımını kullanın, mol2 formatında kaydedin ve bir ligand dosyası olarak kullanın.
3. Yapısal Biyoinformatik Araştırma İşbirliği (RCSB) Protein Veri Bankası (PDB) veritabanından çekirdek hedeflerin 3B yapısının pdb formatını bulun ve indirin. Protein yapısından su moleküllerini ve ligandları çıkarmak, pdb formatında kaydetmek ve bir reseptör dosyası olarak kullanmak için Pymol 2.4.0 yazılımını kullanın.
4. Reseptör pdb dosyasını hidrojenasyon için AutoDockTools 1.5.7 yazılımına aktarın, hem reseptör proteinini hem de küçük moleküllü ligandı pdbqt formatına dönüştürün, Aralık katsayısı 1'e ayarlanmış reseptör proteini için aktif cebi ayarlayın.
5. Moleküler yerleştirme için Autodock vina 1.2.0'ı kullanın ve bağlanma enerjisini hesaplayın; Afinite < 0 ise, molekülün protein ile kendiliğinden bağlandığını düşünün, Afinitenin daha büyük mutlak değeri, aralarında daha kararlı bir bağlanma olduğunu gösterir. Son olarak, Pymol 2.3.0 ve LigPlot 2.2.5 yazılımını kullanarak yerleştirme sonuçlarını görselleştirin.

4. Moleküler dinamik simülasyon

1. Desmond yazılımını kullanarak MD simülasyonları gerçekleştirmek için şu adımları izleyin:
   1. Protein-ligand etkileşimlerinin kararlılığını ve esnekliğini değerlendirmek için Desmond yazılımının 2019-1 akademik sürümünü kullanın.
   2. Kenetlenme çalışmalarından elde edilen en umut verici ligand komplekslerinin üçlüsü üzerinde moleküler dinamik (MD) araştırmalar yapın. Fizyolojik iyonik koşulları çoğaltarak 0,15 M NaCl içeren bir SPC sulu ortamda simülasyonlar gerçekleştirin. Simülasyon kutusu, çözünen maddenin sınırlarından en az 10 şuzakta kalmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Sistemin elektrik yükünü nötralize etmek için karşı iyonlar tanıtılır. Ek olarak, OPLS 2005 kuvvet alanının parametreleri tarafından yönetilen periyodik sınır koşulları uygulanır.
   3. Desmond varsayılan parametrelerini kullanarak 100 ps için bir enerji minimizasyonu aşaması başlatın.
   4. Tüm üretim MD sistemlerinde Nosé-Hoover zinciri ve Martyna-Tobias-Klein metodolojileri aracılığıyla 26,85 °C (300 K) ve 1,01325 bar'da sıcaklık ve basınç stabilizasyonu sağlayın. Moleküler dinamik simülasyonu, toplam 100 ns'lik bir süre boyunca 2 fs'lik bir zaman adımı ile yürütülür ve atomik koordinatlar her 100 ps'de bir kaydedilir.
   5. Simülasyon etkileşimleri diyagramı (SID) modülünü açın. Simülasyon sonuç veri dosyalarını modüle yükleyin.
   6. Modülde bulunan seçeneklerden istediğiniz analiz türünü seçin (örneğin, kök-ortalama-kare sapması [RMSD], kök ortalama kare dalgalanması [RMSF], hidrojen bağı analizi, vb.). Seçilen analiz türü için gereken ek parametreleri belirtin.
   7. Analiz Et veya Başlat düğmesine tıklayarak analizi çalıştırın.
   8. Analiz tamamlandıktan sonra, sonuçları SID modülü arayüzünde görüntüleyin ve yorumlayın. Gerekirse daha fazla kullanım veya sunum için sonuçları dışa aktarın.

5. Hayvan deneyi doğrulaması

1. Hayvanlar ve deney tasarımı
   NOT: Bu çalışma, SPF dereceli bir hayvan üretim tesisinden elde edilen ve vücut kütlesi 150 g ± 20 g olan 8 haftalık 75 erkek Sprague-Dawley sıçanını içermektedir (hayvansal üretim sertifikası numarası SCXK [Hebei] 2018-004).
   1. Sıçanları SPF düzeyinde bir hayvan laboratuvarında barındırın ve 1 haftalık adaptif beslenmeden sonra rastgele normal ve model gruplarına bölün. Normal gruba normal bir diyet, model gruba ise yüksek şekerli ve yüksek yağlı bir diyet sağlayın. 4 hafta sonra, fareleri oruç tutun, ancak 12 saat boyunca sudan mahrum etmeyin.
   2. Model grubuna intraperitoneal Streptozotosin enjeksiyonu (STZ; 35 mg · ^kg-1) enjekte edin. 72 saat sonra, kuyruk damarı kan örneklemesi ile kan şekeri seviyelerini test edin. Açlık kan şekeri seviyesi ≥16.7 mmol· ^L-1, başarılı bir diyabetik model olarak onaylayın.
   3. Sıçan böbreğindeki histopatolojik değişiklikleri gözlemleyerek başarılı DN modelini onaylayın.
   4. Başarılı bir şekilde çoğaltılan modelleri, 4.37 g / kg, 8.73 g / kg ve 17.46 g / kg (klinik eşdeğer dozun 3.2, 6.3 ve 12.6 katına eşdeğer) JWSJS alan model grubuna rastgele bölün ve ayrıca bir irbesartan grubu (0.014 g / kg). Her grup 10 sıçandan oluşuyordu. Tüm ilaçları günde bir kez oral gavaj yoluyla uygulayın. Bu doz rejimini 4 hafta boyunca tutarlı bir şekilde sürdürün.
   5. % 1 pentobarbital sodyum (50 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyon kullanarak sıçanları uyuşturun ve pedal çekme refleksi kaybıyla uygun anesteziyi doğrulayın. Ötenaziden önce abdominal aorttan kan örnekleri toplayın.
   6. 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal sodyum pentobarbital enjeksiyonu kullanarak sıçanları ötenazi yaptıktan sonra böbrekleri toplayın.
      NOT: Hayvanlar, ötenazi için en güncel Amerikan Veteriner Hekimler Birliği (AVMA) yönergelerine (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) uygun olarak insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı.
2. Renal histoloji analizleri
   NOT: Böbrek dokuları% 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve 48 saat sonra etanolde dehidre edildi; Bölümler parafine gömüldü. Kesitler hematoksilen ve eozin (HE) ve Periyodik asit-Schiff (PAS) boyaması için ince (4 μm) dilimler halinde kesildi ve böbrek histolojisindeki morfolojik değişiklikler ışık mikroskobu altında gözlendi.
   1. HE boyama:
      1. Mum alma ve hidrasyon: Doku bölümlerini Ksilen I ve II (her biri 10 dakika), mutlak alkol I ve II (her biri 3 dakika) ile tedavi edin. Ardından, doku bölümlerini %95, %90, %80 ve %70 etanole (her biri 2 dakika) daldırın ve ardından 5 dakika damıtılmış suyla yıkayın.
      2. Doku bölümlerini 5 dakika boyunca hematoksilen boyasına yerleştirin ve ardından bölümleri 5 saniye boyunca hidroklorik alkol ile ayırt edin.
      3. Bölümü 3 dakika boyunca eozin boyama solüsyonuna yerleştirin.
      4. Dehidrasyon, temizleme ve montaj: Bölümleri farklı etanollerde (%70, %80, %90, %95 ve mutlak etanoller) çeşitli zamanlarda kurutun, ardından ksilen I ve II'de temizleyin, ardından nötr sakız ile monte edin.
   2. PAS Boyama:
      1. Adım 5.2.1'de açıklanan mum alma adımlarını izleyin ve bölüme ~8 dakika boyunca periyodik asit boyama solüsyonu uygulayın.
      2. Bölümleri damıtılmış suda 2 dakika durulayın ve ardından karanlıkta 15 dakika boyunca Schiff Reaktifi ile boyayın.
      3. Bölümleri Schiff reaktifi ile işlemden geçirdikten sonra 10 dakika musluk suyunda yıkayın.
      4. Bölümleri hematoksilen kullanarak 1 dakika boyunca lekeleyin ve ardından 30 saniye boyunca HCl-alkol ile ayırt edin. Çekirdeği maviye boyamak için bölümleri tekrar musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
   3. Elektron mikroskobu:
      1. Numuneleri 3 saat boyunca% 2.5 glutaraldehit içinde sabitleyin, ardından 3 saat boyunca PBS'de durulayın. Ayrıca, numuneleri 3 saat boyunca% 1 osmik asit içinde muamele edin ve ardından 3 saat boyunca PBS'de tekrar durulayın.
      2. Aseton ile biten kademeli bir dizi alkol banyosu ile kurutun (her adım toplamda yaklaşık 2 saat sürer).
      3. Numuneleri epoksi propan ve epoksi reçine karışımı (1:1) ile oda sıcaklığında (RT) 2 saat, ardından 37 °C'de 2 saat daha saf epoksi reçine ile sızdırın.
      4. Bundan sonra, kesitlere ayırmadan önce 36 saatlik bir süre boyunca numuneleri giderek artan yüksek sıcaklıklarda sertleştirin ve sertleştirin. Bu işlem, dokunun reçine ile iyice sızmasını sağlar, bu daha sonra elektron mikroskobu için ince dilimlemeye izin verecek şekilde sertleştirilir.
      5. % 3 uranil asetat ve kurşun asit ile çift boyayın ve numuneleri 15 dakika içinde elektron mikroskobu ile gözlemleyin ve fotoğraflayın.
         NOT: Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ayarları aşağıdaki gibidir: yüksek kontrast modunda (Zoom-7000 HC-1) 1x büyütme, bir TEM sisteminde 80.0 kV'luk bir hızlanma gerilimi ile.
3. İmmünohistokimya
   1. Mum alma: Doku bölümlerini her biri 10 dakika boyunca ksilen I ve II'ye yerleştirin.
   2. Rehidrasyon: Mumdan arındırılmış doku bölümlerini, her biri 3 dakika boyunca art arda mutlak etanol I ve II'ye, ardından her biri 2 dakika boyunca %95, %90, %80 ve %70 etanole yerleştirerek rehidre edin.
   3. Antijen alımı: Doku bölümlerini yaklaşık 5 dakika boyunca yüksek basınç altında 0.1 M sitrat-sitrik asit tampon çözeltisine daldırın ve ardından RT'ye soğutun.
   4. Bloklama: Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, doku bölümlerini %5 normal keçi serumu ile yaklaşık 37 ° C'de 30 dakika inkübe ederek bloke edin.
   5. Birincil antikor inkübasyonu: Birincil antikorlar p-EGFR (1:200 seyreltilmiş) ve p-MAPK3/1 (1:200 seyreltilmiş) doku kesitlerine ekleyin ve nemlendirilmiş bir oda içinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   6. İkincil antikor inkübasyonu: Bölümleri PBS ile üç kez yıkayın, ardından bölümlere biyotin etiketli ikincil antikorlar (üreticinin talimatlarına göre PBS'de seyreltilmiş) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   7. Yaban turpu peroksidaz ile konjuge streptavidin çalışma solüsyonunu 37 ° C'de doku bölümlerine uygulayın ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak üç kez yıkayın.
   8. DAB gelişimi için, bölümleri DAB geliştirme solüsyonu ile inkübe edin (RT'de karanlıkta 3 dakika), ardından damıtılmış su ile durulayın. DAB, oksidasyon üzerine kahverengiye dönüşen yaban turpu peroksidaz (HRP) enzimi için bir kromojen substrat görevi görür.
   9. Yaklaşık 2 dakika boyunca karşı boyama için hematoksilen kullanın, bölümleri 5 saniye boyunca% 1 hidroklorik alkol ile ayırt edin, ardından maviye dönene kadar akan su altında yıkayın.
   10. Bölümleri art arda düşükten yüksek konsantrasyona bir dizi etanol içine yerleştirerek dehidre edin, ksilen I ve II'de berrak olun ve bölümleri nötr sakız ile monte edin.
       NOT: Bu prosedür, gece boyunca primer antikor inkübasyonu dahil olmak üzere yaklaşık 18-24 saat sürer.
   11. Her bölüm için rastgele üç görsel alan (200x) seçin ve görüntü analiz yazılımı kullanarak bölümlerin boyama sonuçlarını analiz edin. Aşağıdaki adımlar izlenerek Image Pro Plus 6.0 yazılımı kullanıldı.
   12. İlk olarak, bölümün bir görüntüsünü yazılıma aktarın.
   13. Yoğunluk düzeltmesi: Doğru sonuçlar elde etmek için bir yoğunluk düzeltmesi yapın.
       1. Yeni > Std. İsteğe Bağlı Yoğunluk > Seçenekler > Görüntüyü > Ölçümü > Kalibrasyonu > Yoğunluğu Seçin. Ardından, arka plan değerini kaydetmek için görüntünün boş bir alanına tıklayın ve Tamam'a tıklayarak onaylayın.
   14. Ölçüm parametrelerinin ayarlanması: Alanı ve entegre optik yoğunluğu (IOD) hesaplamak için ölçüm parametrelerini ayarlayın.
       1. Ölçü > Sayı/Boyut > Ölçü'ye tıklayın > Ölçümler'i seçin. Alan(100) ve IOD'yi seçin, ardından Tamam'a tıklayın.
       2. Seçenekler'e gidin, Örnekte Koyu Arka Plan, 4-Connect Ön Filtre'yi işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
   15. Renk seçimi: Pozitifliği doğru bir şekilde belirlemek için, lekeli alanları ve lekesiz alanları algılamak için renkleri seçin.
       1. HSI > Histogram Tabanlı > Renk Seç'e tıklayın. S değişmeden ve I'yi sıfır ile arka plan değeri arasında tutarken H değerini resme göre ayarlayın. Ardından, Kapat'a tıklayarak onaylayın.
       2. Veri toplama ve hesaplama: Ad, Alan (Toplam) ve IOD (Toplam) seçiliyken Veri Toplayıcı > Düzen > Ölç'e tıklayarak veri toplama ve hesaplama gerçekleştirin. Ardından, verileri daha fazla analiz > depolama için dışa aktarmak için Şimdi Topla > Veri Listesi'ne tıklayın.
          NOT: Bu, analiz edilen toplam alana göre ne kadar protein bulunduğunu gösteren IOD/Alan cinsinden her bölümde protein ekspresyonunun yarı kantitatif bir ölçümü ile sonuçlanmıştır.
4. Batı lekeleme
   1. Böbrek dokusunu elde edin ve parçalara ayırın. Bu parçaları 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin, önceden soğutulmuş protein lizis çözeltisini (50 mM Tris [pH 7.4],150 mM NaCl, %1 Triton X-100, %1 sodyum deoksikolat, %0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS]) ekleyin ve homojenize edin.
   2. 30 dakika buz üzerinde bırakın, ardından 13400 x g'da 20 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Elde edilen numuneyi -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
   3. Proteinleri ölçmek için Bradford yöntemini kullanın.
      1. Reaktif ve damıtılmış suyu 1:4 oranında karıştırarak Coomassie Brilliant Blue çalışma solüsyonunu hazırlayın.
      2. Üç grup oluşturun - boş, standart protein grubu ve örnek protein grubu. Her gruba 3 mL Coomassie Brilliant Blue çalışma solüsyonu, boş grup için fizyolojik salin, standart grup için standart protein ve numune grubu için ekstrakte edilmiş süpernatan protein ekleyin.
      3. Karışımları 5 dakika beklettikten sonra, bir ultraviyole spektrofotometre kullanarak absorbans değerlerini ölçün.
      4. Şu formülü kullanarak numune konsantrasyonunu hesaplayın: Protein konsantrasyonu (mg/mL) = (Numune absorbans değeri/Standart tüp absorbans değeri) x Standart protein konsantrasyonu x 5.
   4. Her protein örneğine eşit hacimde 6x yükleme tamponu ekleyin. 100 °C'de 5 dakika kaynattıktan sonra tekrar kullanın ve tekrar kullanana kadar -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
   5. Standart elektroforez, lekeleme ve engelleme gerçekleştirin.
      1. %12 çözünen jel kullanarak standart SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) gerçekleştirin. İstifleme jeli için 100 V ve çözme jeli için 120 V'luk sabit bir voltaj uygulayın, boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar.
      2. Proteinleri, ıslak bir transfer sistemi kullanarak 4 ° C'de soğuk bir odada 2 saat boyunca 100 V'ta poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
      3. Protein transferinden sonra, RT'de 1 saat boyunca TBST'de% 5 yağsız süt ile zarları bloke edin.
   6. Primer antikorları EGFR (1: 2.000), p-EGFR (1: 2.000), MAPK3 / 1 (1: 2.000), p-MAPK3 / 1 (1: 2.000), Bcl-2 (1: 2.000), BAX (1: 2.000) ve CAPDH (1: 5.000) % 5 BSA ile TBST'de. Bu seyreltilmiş primer antikorları ekleyin ve zarları gece boyunca 4 ° C'de hafif çalkalama ile inkübe edin.
   7. Membranı TBST ile üç kez yıkadıktan sonra, seyreltilmiş ikincil antikorlar (1: 5.000) ekleyin, ardından 1 saat inkübe edin. Renk geliştirme sonrası, ImageJ yazılımını kullanarak hedef bantların nicel analizini yapın.
5. qPCR analizi
   1. Gruplama: Gruplara örnek atayın - Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
   2. RNA ekstraksiyonu: Doku homojenizasyonu ve RNA ekstraksiyonu, ardından üreticinin talimatlarına göre kloroform ilavesi, santrifüjleme ve RNA çökeltme işlemlerini gerçekleştirin.
   3. RNA çökeltme ve yıkama: RNA'yı izopropanol ile çökeltin ve etanol ile yıkayın.
   4. RNA Çözündürme: RNA peletini kurutun ve DEPC ile arıtılmış suda çözün.
   5. cDNA Sentezi: Üreticinin talimatlarına göre belirli reaksiyon karışımlarını kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin.
   6. qPCR Amplifikasyonu: qPCR için GAPDH, MAPK3, MAPK1 ve EGFR için özel primerler kullanın ve üreticinin talimatlarına göre amplifikasyon gerçekleştirin.
      Primer dizileri aşağıdaki gibidir:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. İstatistiksel yöntemler

1. Analizi uygun yazılım (örneğin, SPSS) kullanarak gerçekleştirin ve ölçülen verileri ortalama ± standart sapma(lar) olarak gösterin. Veriler normal dağılım ve varyans homojenliği kriterlerini karşılıyorsa, tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasında karşılaştırma yapın ve Bonferroni yöntemi ile çoklu karşılaştırmalar yapın.
2. Varyans homojen değilse çoklu karşılaştırmalar için T2 testini kullanın. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.

Sonuçlar

Protokolün ardından, JWSJS'nin 90 aktif bileşeni, belirlenen OB ve DL standartlarına göre tarama ve tekilleştirmeden sonra analizden nihayet elde edildi. Bunlar arasında 20 çeşit Hedysarum Multijugum Maxim, 23 çeşit Epimrdii Herba, 15 çeşit Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 çeşit Radix Rhei et Rhizome, dört çeşit Curcumaelongae Rhizoma, 15 çeşit Cicadae Periostracum ve altı çeşit Bombyx Batryticatus bileşen...

Tartışmalar

Çalışmamızda ağ farmakolojisi, moleküler yerleştirme ve in vivo hayvan modellerinin bir kombinasyonu kullanılmıştır. Kritik bir adım, özellikle EGFR / MAPK3 / 1 sinyal yolu ile etkileşimine odaklanarak, DN tedavisinde JWSJS'nin potansiyel mekanizmalarını belirlemek için çok önemli olan "ilaç-bileşen-hedef" ağının kurulmasıydı.

Bu çalışma sırasında, tahminlerimizin doğruluğunu artırmak için özellikle moleküler yerle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2×SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio, Wuhan, China	G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
3,3'-Diaminobenzidine	Shanghai Huzheng Biotech, China	91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument	Hitachi, Japan	7170A
Anhydrous Ethanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
BAX Primary antibodies	Affinity, USA	AF0120	Rat
BCL-2 Primary antibodies	Affinity, USA	AF6139	Rat
BX53 microscope	Olympus, Japan	BX53
Chloroform Substitute	ECOTOP, Guangzhou, China	ES-8522
Desmond software	New York, NY, USA	Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath	Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China	DK-8D
EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF6043	Rat
Embed-812 RESIN	Shell Chemical, USA	14900
Fasting blood glucose (FBG)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser	Multiskan; Thermo, USA	N/A
GAPDH  Primary antibodies	Affinity, USA	AF7021	Rat
Glycated serum protein (GSP)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
Transmission electron microscope	Hitachi, Japan	H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution	Servicebio, USA	G1003
Image-Pro Plus	MEDIA CYBERNETICS, USA	N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument	Applied Biosystems, USA	iQ5
Irbesartan tablets	Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals	N/A
Isopropanol	Biosharp, Tianjin, China	N/A
JWSJS granules	Guangdong Yifang Pharmaceutical	N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system	Kodak, USA	IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)	Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering	N/A
MAPK3/1Primary antibodies	Affinity, USA	AF0155	Rat
Medical Centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China	TGL-16K
Mini trans-blot transfer system	Bio-Rad, USA	N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system	Bio-Rad, USA	N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer	Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden	111765
p-EGFR Primary antibodies	Affinity, USA	AF3044	Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution	Servicebio, USA	G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies	Affinity, USA	AF1015	Rat
Secondary antibodies	Santa Cruz, USA	sc-2357	Rabbit
Streptozotocin	Sigma, USA	S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit	GeneCopeia, USA	QP056T
TriQuick Reagent	Solarbio, Beijing, China	R1100
Ultra-Clean Workbench	Suzhou Purification Equipment, China	SW-CJ-1F