İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu Sonrası Fare Yavrularında Kan Şekerinin İzlenmesi

Özet

Burada, intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)-embriyo transferi (ET) fare modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz, bu da ICSI'ye atfedilebilecek glikoz metabolizmasındaki yaşa bağlı değişiklikleri gözlemlememize olanak tanıyarak insan gelişimi üzerindeki potansiyel uzun vadeli etkileri hakkında bilgi veriyor.

Özet

İnsan ömrü oldukça uzundur, fare modelleri ise tüm insan ömrünü nispeten kısa bir süre içinde simüle edebilir ve bir yıllık fare ömrü kabaca 40 insan yılına eşittir. İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI), klinik pratikte yaygın olarak kullanılan bir yardımcı üreme teknolojisidir. Bununla birlikte, yaklaşık 30 yıl önce nispeten yeni ortaya çıktığı göz önüne alındığında, bu tekniğin insani gelişme üzerindeki uzun vadeli etkileri belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmada, bir fare modeli kullanılarak embriyo transferi (ET) yöntemi ile kombine ICSI'yi kurduk. Sonuçlar, normal fare sperminin in vitro kültür ve ardından ICSI uygulandıktan sonra %89.57'lik bir döllenme oranı ve %87.38'lik bir iki hücreli oran sergilediğini gösterdi. ET'yi takiben, yavruların doğum oranı yaklaşık% 42.50 idi. Ayrıca, fareler yaşlandıkça, ICSI tekniğinin uygulanmasıyla ilişkili olabilecek glikoz metabolizması seviyelerinde dalgalanmalar gözlenmiştir. Bu bulgular, fare ICSI-ET tekniğinin, sperm anormalliklerinin embriyo gelişimi üzerindeki etkisini ve bunların özellikle glikoz metabolizması ile ilgili olarak yavru sağlığı üzerindeki uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için değerli bir platform sağladığını göstermektedir. Bu çalışma, ICSI tekniğinin insani gelişme üzerindeki potansiyel etkileri hakkında daha fazla araştırma için önemli bilgiler sağlamakta ve bu teknolojinin uzun vadeli etkilerinin derinlemesine araştırılmasının gerekliliğini vurgulamaktadır.

Giriş

Doğurganlık sorunları, özellikle azalan doğurganlık oranlarının ve kısırlık prevalansının ve şiddetinin artan şiddetinin öne çıktığı modern toplumda, tıbbi ve sosyolojik kaygıların önemli bir odağı olarak ortaya çıkmıştır. Yardımcı Üreme Teknolojisi (ART), terapötik bir müdahale olarak yaygın olarak kullanılan İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI) ile bu zorlukların üstesinden gelmek için çok çeşitli olanaklar sunar.

Palermo'nun 1992 yılında İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI) ile elde edilen ilk başarılı gebeliği bildirmesinden bu yana, ICSI Yardımcı Üreme Teknolojilerinde (^{ART) çok} önemli bir teknik haline gelmiştir1. Bununla birlikte, ICSI'nin klinik ortamlarda sadece 30 yıldır, insan ömrüne kıyasla nispeten kısa bir süre boyunca kullanıldığı göz önüne alındığında, ICSI'nin özellikle yavru gelişimi üzerindeki uzun vadeli etkileri kapsamlı bir şekilde araştırılmamış ve aydınlatılmamıştır. Şu anda, tek tip genetik geçmişleri ve daha kısa ömürleri ile karakterize edilen fareler, tıbbi araştırmalarda yaygın olarak kullanılan alternatif bir model olarak ortaya çıkmıştır. Dahası, fare modeli, farelerde bir yılın insanlarda kabaca 40 yıla karşılık geldiği sıkıştırılmış bir zaman çerçevesi içinde tüm insan ömrünü özetleyebilir².

Son on yılda, birkaç küçük ölçekli çalışma, ICSI yoluyla gebe kalan bireylerin, daha sonraki yaşamlarında anormal kan şekeri seviyeleri gibi metabolik sendromlar geliştirme riskinin artabileceğini bildirmiştir ^3,4. Kanıtlar kesin olmasa da, bu bulgu yine de bilim camiasında ICSI'nin uzun vadeli sağlık etkileri konusunda ciddi endişelere yol açmıştır. Bu durum, ART'nin ve uzun vadeli sağlık sonuçlarının daha titiz bir şekilde değerlendirilmesine duyulan acil ihtiyacın altını çizmektedir. Özellikle insan çalışmalarının sınırlamaları ve etik hususları ışığında, ICSI'yi takiben insan yavrularının gelişimini tam olarak özetleyebilecek hayvan modellerinin geliştirilmesi giderek daha önemli hale gelmiştir. Bu bağlamda, fare ICSI-ET (İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu-Embriyo Transferi) modeli, insan ICSI'sini taklit etme ve yavru sağlık sonuçlarının uzun vadeli izlenmesini kolaylaştırma kapasitesi nedeniyle, ICSI teknolojisinin yavrulara yönelik potansiyel sağlık risklerini değerlendirmek için etkili bir araç haline gelmiştir⁵.

Bu çalışma, farelerin glikoz metabolik durumunu değerlendirmek için rastgele kan şekeri izleme, açlık kan şekeri testi ve glikoz tolerans testleri kullanarak ICSI-ET teknolojisinin yaygın bir metabolik fenotip, yani yavru glikoz metabolik sağlığı üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlamaktadır. Normal fizyolojik aktiviteler sırasında glikoz metabolizmasındaki doğal dalgalanmaları yakalamak için rastgele kan şekeri izlemesi kullanılırken, potansiyel prediyabetik durumları değerlendirmek için açlık kan şekeri ve glikoz tolerans testleri kullanılır.

Protokol

Aşağıda açıklanan ICSI-ET protokolü, yönergeleri takip eder ve Şanghay Planlı Ebeveynlik Araştırmaları Enstitüsü'nün Hayvan Etik İncelemesi tarafından onaylanmıştır. Güvenlik Prosedürleri: Kimyasalları veya biyolojik malzemeleri kullanırken daima uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Davlumbaz Kullanımı: Sertifikalı bir çeker ocak veya biyogüvenlik kabini içinde uçucu kimyasallar veya aerosol oluşumunu içeren tüm prosedürleri gerçekleştirin. Süperovülasyon prosedürü için dişi fareler (6-8 haftalık B6D2F1 suşu) kullanın.

1. Farelerde ICSI

1. Farelerin süper yumurtlaması
   1. İlk gün saat 20: 00 civarında fare başına 7.5 IU'luk bir dozda intraperitoneal hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) enjeksiyonu uygulayın.
   2. Üçüncü gün saat 20: 00 civarında (PMSG enjeksiyonundan 48 saat sonra) fare başına 7.5 IU'luk bir dozda intraperitoneal insan koryonik gonadotropin (HCG) enjeksiyonu uygulayın.
2. HTF ortamını 1 mL'lik alikotlara hazırlayın ve dişi farelerde HCG enjeksiyonunun aynı gününde% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca dengeleme için açıkta bırakın.
3. ICSI gübreleme damlacıklarının hazırlanması
   1. Dişi farelerde HCG enjeksiyonunun aynı gününde, 50 x 9 mm'lik bir hücre kültürü kabı kapağını üst ve alt yarıya bölün. Sperm yerleştirme için %10 polivinilpirolidon (PVP) kullanarak her biri 5 μL'lik 4-6 damlacık oluşturmak için üst yarısını kullanın. ICSI prosedürü için M2 ortamını kullanarak her biri 5 μL'lik 8-10 damlacık oluşturmak için alt yarıyı kullanın.
   2. PVP ve M2 ortam damlacıklarını yaklaşık 3 mL mineral yağ ile örtün (Şekil 1).
4. Kültür yemeklerinin hazırlanması
   1. Dişi farelerde HCG enjeksiyonunun aynı gününde, 35 x 10 mm'lik bir hücre kültürü kabına 20 μL'lik 12 damla KSOM ortamı (MR-020P-D) eşit olarak dağıtın. Damlaları yaklaşık 3 mL mineral yağ ile örtün.
5. Sperm toplama:
   1. Dördüncü gün (HCG enjeksiyonundan 13 saat sonra) yaklaşık 9: 00'da servikal çıkık ile erkek farelere ötenazi yapın.
   2. Epididimal kaudayı izole edin ve steril gazlı bezle nazikçe lekeleyerek ve önceden ısıtılmış HTF ortamında durulayarak yağ dokusu ve kan kalıntılarını ortadan kaldırmak için iyice temizleyin.
   3. Spermin HTF ortamına serbestçe yüzmesine izin vermek için kauda epididimini kesin. Spermi serbest bırakmak için forseps kullanarak kaudayı hafifçe sıkın, bunları önceden dengelenmiş HTF tüplerinde toplayın ve daha fazla kullanım için sperm kapasitasyonu için 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde açıkta tutun.
6. Oosit alımı
   1. Dördüncü gün saat 9:30 civarında servikal çıkık ile oosit alımı için uyarılan dişi farelere ötenazi yapın. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için karın derisinin ve kas tabakasının orta hattı boyunca dikkatlice bir kesi yapın.
   2. Yumurta kanallarının her iki tarafından, özellikle şişmiş ampulla bölgelerinden dokuyu nazikçe izole etmek için ince forseps kullanın ve sterilize edilmiş bir kültür kabında M2 ortamına aktarın. Belirtilen tüm farelerden yumurta kanalları toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
   3. Diseksiyon mikroskobu altında, yumurta kanalının şişmiş ampullasının şeffaf bölümünü nazikçe delmek için 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanın ve kümülüs-oosit komplekslerinin (COC'ler) ortama salınmasını kolaylaştırın.
   4. Aynı şırıngayı kullanarak, COC'leri dikkatlice seçin ve 100 μL taze M2 ortamı içeren yeni bir tabağa aktarın. Tüm COC'ler orijinal yumurta kanalı segmentlerinden başarıyla aktarılana kadar bu adımı tekrarlayın.
   5. Kan ve doku sıvılarını silin ve diseksiyon mikroskobu altında, 25 G'lik bir iğne kullanarak yumurta kanalının ampullasını yırtın, bu da çok sayıda COC'nin salınmasına neden olur.
   6. Yumurta kanalını ve doku parçalarını çıkarın, COC'leri hyaluronidaz (HY) içeren M2 ortamı damlacıklarına aktarın ve bunları 37 ° C'ye ısıtın.
   7. Yaklaşık 5 dakika inkübe edildikten sonra, kümülüs hücrelerinin ve oositlerin ayrılmasını kolaylaştırmak için nazik pipetleme yapın. Metafaz II (MII) oositlerini HY içeren çözeltiden taze M2 ortamına aktarın; daha sonra, M2 ortamının birden fazla damlacıklarına sıralı aktarımı gerçekleştirin.
   8. 2-3 tur yıkamadan sonra, oositleri KSOM kültür ortamı damlacıklarına aktarın ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde saklayın.
7. Dördüncü gün saat 10:00 civarında, 50 watt'lık bir güç ayarı ile 46 kHz frekansında kafaları kuyruklardan ayırmak için 100 μL kapasiteli spermi 5 saniye boyunca sonike edin (bkz. adım 1.5.2).
   NOT: Kuyruğu kesmek için spermi sonikasyon yaparken, 5 saniyeyi geçmemesi gereken süreyi kontrol etmek için dikkatli olun. Sonikasyondan birkaç saniye sonra, sperm ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemlenebilir; Spermin yaklaşık yarısı kesilmiş kuyruklar gösterdiğinde sonikasyonu durdurun.
8. ICSI prosedürü
   1. Enjeksiyon için düz uçlu ve 6 μm iç çapa sahip, 25 ° açıyla ayarlanmış, piyasada bulunan bir mikromanipülasyon iğnesi kullanın. İğneyi, iğnenin içinde 0,5 cm uzunluğunda doldurulmuş kısım ile çalışma sıvısı ile doldurun. Sıvı seviyesinin ~0,5 cm'ye ulaştığından emin olun.
      NOT: Döllenmiş oositlerin hayatta kalma oranını azaltabilecek yüksek sıcaklıklardan kaçınmak için enjeksiyon sırasında oda sıcaklığını 19 °C'de tutun. Sıvı seviyesinin 0,5 cm'ye ulaşmasını sağlamadaki hassasiyet, enjeksiyon işleminin bütünlüğünü korumak ve oositlerin canlılığını sağlamak için çok önemlidir.
   2. Enjeksiyon iğnesini mikromanipülatörün sağ koluna takın, tutma kapağını sıkarak güvenli bir şekilde sabitleyin. Mikromanipülatörün sol koluna fare oositleri için tasarlanmış, piyasada bulunan düz uçlu bir mikromanipülasyon tutma pipeti takın ve enjeksiyon iğnesini ve tutma pipetini mikroskobun görüş alanına yerleştirin.
   3. Bir pipet kullanarak bir damla PVP çözeltisine 1 μL sonikasyonlu sperm ekleyin.
   4. 20 MII oositi M2 ortamındaki bir damlacığa yerleştirin.
   5. PVP solüsyonunda 10-20 sperm kafasını aspire etmek için enjeksiyon iğnesini kullanın. Ardından, enjeksiyon iğnesini oositleri içeren damlacığın içine doğru hareket ettirin.
   6. İğ aparatının enjeksiyon tarafında olmadığından emin olmak için bir polarizasyon mikroskobu altında oosit içindeki metafaz milinin konumunu doğrudan belirleyin, polar gövde tipik olarak oositin yönüne göre saat 12 veya saat 6 konumunda bulunur.
   7. Oositi kültür kabının alt kısmı ile temas halinde tutun. Odak düzlemini, oositin zona pellucida'sı ve enjeksiyon iğnesi aynı düzlemde olacak şekilde ayarlayın.
   8. Enjeksiyon iğnesinin zona pellucida ile teması üzerine, zona pellucida'nın bir kısmını çizerek enjeksiyon iğnesine hafif bir negatif basınç uygulayın.
   9. Piezo darbelerini 5 yoğunluk ayarı ve 1 frekansla aynı anda etkinleştirin, zona pellucida'da etkili bir şekilde bir delik oluşturun ve enjeksiyon iğnesinin geçmesine izin verin.
   10. Enjeksiyon iğnesini perivitellin boşluğuna ilerletin ve sperm kafasını iğnenin ucuna itin. Enjeksiyon iğnesini, zona pellucida'nın karşı tarafına ulaşana kadar oositin içine sokun.
   11. Plazma zarında küçük bir gözenek oluşturmak için 1 yoğunluğa ve 1 frekansa ayarlanmış piezo darbeleri kullanın, böylece sperm kafasının minimum PVP girişi ve oosit bütünlüğünün en iyi şekilde korunması ile ooplazmaya enjekte edilmesini sağlayın.
   12. 20 oositin tümü enjekte edilene kadar 1.8.11 adımını tekrarlayın, ardından 19 ° C'de 15 dakikalık bir inkübasyon yapın.
   13. Hayatta kalan oositleri KSOM ortamına aktarın ve inkübatöre yerleştirin. 2 hücreli, 4 hücreli, morula ve blastosist oluşum oranlarını gözlemleyin.
       NOT: Oosit içine intrasitoplazmik tek sperm enjeksiyonu (ICSI) için zamanlama kontrol edilmeli ve HCG enjeksiyonundan sonraki 14-18 saat içinde prosedürün tamamlanması hedeflenmelidir.

2. Fare blastosistlerinin uterus nakli

1. Vasektomize erkek farelerin hazırlanması
   NOT: Çalışma için 6-8 haftalık ICR erkek fareleri kullanın.
   1. 0.2 mL / 10 g vücut ağırlığı dozunda% 1.25 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu ile anesteziyi indükleyin. Herhangi bir ağrı yanıtının olmaması anestezinin başarılı olduğunu gösterir.
      NOT: Mevcut protokol, anestezi uygulanmış hayvanların gözlerine veteriner merhemi uygulanmasını içermemekle birlikte, göz kuruluğunu önlemek ve prosedürler sırasında hayvanların sağlığını ve rahatını sağlamak için en iyi uygulama olarak önerilmektedir. Cerrahi ve iyileşme süreci boyunca tüm cerrahi aletler kullanılmadan önce sterilize edildi ve temiz bir ameliyat ortamı sağlamak için cerrahi alan antiseptik solüsyonlar kullanılarak hazırlandı.
   2. Potansiyel stres veya yaralanmalara karşı korunmak için, ilk iyileşme aşamasında ameliyat geçiren fareleri ayrı ayrı barındırın.
   3. Optimal ağrı kesici sağlamak için buprenorfini vücut ağırlığının 0.05 mg / kg'ı bir dozda uygulayın.
      NOT: Farelerin refahını sağlamak için, iyileşme döneminde fareleri yakından izleyin ve sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar onları gözetimsiz bırakmayın.
   4. Cerrahi bölgeyi, testislerin üstünde, alt karın bölgesinde hazırlayın. Kürkü çıkarın ve povidon-iyot ile dezenfekte edin. Steril makas kullanarak linea alba boyunca 1 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Steril, tozsuz bir kağıtla kanı nazikçe alın ve karın kaslarını linea alba boyunca künt bir şekilde incelemeye ve karın boşluğuna erişmeye devam edin.
   5. Kavisli forseps kullanarak, sol testisi ve onunla ilişkili yağ pedini nazikçe kavrayın ve açığa çıkarın. Vas deferens'i tanımlayın ve sivri forseps kullanarak dikkatlice izole edin, manipülasyon için 10 mm'lik bir segment oluşturun.
   6. Kavisli forsepsleri birkaç saniye boyunca bir alkol lambasının dış alevinde tutarak sterilize edin. Vas deferens'i nazikçe kavrayın, koterizasyon nedeniyle düzleşmesine ve beyazlaşmasına neden olun. Birincinin 3-5 mm distalinde ikinci bir koterizasyon noktası oluşturun. Steril cerrahi makas kullanarak, iki koterizasyon noktası arasındaki vas deferens segmentini eksize edin.
   7. Vas deferens'in dağlanmış uçlarını dikkatlice inceleyin ve kısa, düzleştirilmiş, beyazlatılmış bir segment kaldığından emin olun. Kavisli forseps kullanarak, testisi ve ilişkili yağ pedini nazikçe karın boşluğuna geri koyun.
   8. Adım 2.1.6'da açıklanan prosedürü karşı taraflı (sağ) tarafta tekrarlayın.
   9. Ameliyat bölgesini dikişler kullanarak kapatın, tipik olarak kas tabakasına bir dikiş ve cilde üç dikiş yerleştirin. Cerrahi insizyonun uygun şekilde hizalandığından emin olun ve povidon-iyot ile dezenfekte edin. Hayvanı gözlem için bir ısıtma yastığına aktarın, hayvan bilincini geri kazanana kadar 10-15 dakika izleyin. İyileştikten sonra hayvanı barınak kafesine geri koyun.
      NOT: Vazektomi ameliyatını takiben, fareler 14 günlük bir iyileşme periyodu ve ardından 1 haftalık bir deneme çiftleşme deneyi gerektirir.
   10. Bu hafta boyunca, vazektomize olmuş erkekleri sürekli olarak dişilerle çiftleştirin ve çiftleşme tıkaçları olan tüm dişilerin gebelik durumunu gözlemleyin. Başarılı çiftleşme, dişi farenin vajinal ağzında sarımsı beyaz, bloklu bir vajinal tıkaç varlığı ile gösterilir.
       1. Fareleri ilk gün 16:00 ile 18:00 saatleri arasında eşleştirin ve ikinci gün 07:00 ile 09:00 saatleri arasında vajinal tıkaçları kontrol edin. Vajinal tıkaçları olan dişilerin 0.5 günde yalancı gebelik durumunda olduğunu düşünün ve bunları sonraki embriyo transfer deneyleri için kullanın. Vajinal tıkaçları olmayan dişileri alıcı gruba geri getirin.
          NOT: Vajinal tıkaçları olmayan bu dişiler, yalancı gebe dişileri hazırlamak için çiftleşme için kullanılmaya devam edilebilir. Tüm tıkalı dişilerin hamile kalmadığından emin olun; Ancak o zaman vazektomize edilmiş erkekler resmi deneyler için kullanılabilir.
       2. Vazektomize erkekler günlük olarak çiftleşebilirken, çiftleşme seansları arasında 1 gün dinlenmeye izin verin.
          NOT: Deneyimlerimize dayanarak, vazektomize erkekler bir yıldan fazla bir süre boyunca yüksek bir çiftleşme oranını koruyabilirler. Bununla birlikte, çiftleşen dişilerde art arda 4-6 deneme boyunca çiftleşme tıkaç üretemeyen vazektomize erkekler çalışmadan çıkarılmalıdır.
2. Yalancı gebe kadınların hazırlanması
   1. ICR dişi fareleri (7-10 haftalık, 25 g'ın üzerinde) vazektomize erkek farelerle (3-6 aylık) 1: 1 oranında çiftleştirerek yalancı gebe dişi fareler oluşturun.
      NOT: Vazektomize edilmiş erkekler, dişi farelerin uterus serviksini uyarmak için kullanıldı ve bu da corpora lutea'nın aktivasyonu ile sonuçlandı.
3. Blastosistlerin aktarılması için pipetin hazırlanması
   1. Nakledilecek embriyoları inkübatörden çıkarın ve 37 ° C sıcaklıkta bir M2 ortamı damlacığına aktarın.
   2. Küçük bir hacimde sıvıyı aspire etmek, az miktarda hava çekmek ve 6-10 embriyoyu aspire etmek için bir transfer pipeti kullanın. Son olarak, pipeti kapatmak için küçük bir hacim daha hava aspire edin.
      NOT: Transfer pipetindeki sıvının uzunluğu 0,5 cm'yi geçmemelidir.
4. Rahim nakli (blastokistler)
   1. Yalancı gebe dişi fareleri tartın (çiftleşmeden 2.5 gün sonra) ve 0.2 mL / 10 g vücut ağırlığı dozunda% 1.25% 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Kulağı forseps ile hafifçe bastırın.
   2. Farelere anestezi uyguladıktan ve alkol dezenfeksiyonu yoluyla asepsi sağladıktan sonra, ventral karın üzerinde orta hat uzunlamasına bir kesi yapın. Gevşek deri altı dokusundan yararlanarak, insizyonu nakil için gerektiği gibi sola veya sağa kaydırın. Periton boşluğuna erişmek için karın duvarı kas tabakasının lomber omurganın ~ 0.5 cm lateralinde künt diseksiyonunu yapmak için küçük makas kullanın.
   3. Atravmatik forseps kullanarak yumurtalıkları, yumurta kanallarını ve uterusu dikkatlice dışlayın.
   4. Bir şırınga iğnesinin ucunu kullanarak, kan damarlarından kaçınarak utero-tubal bileşkenin altındaki uterus duvarında küçük, yukarı açılı bir kesi yapın. Bu kesi rahim boşluğuna erişim sağlar; Yumurta kanalını küçük delikten 2-3 mm yavaşça yerleştirin.
   5. Embriyoların yavaş enjeksiyonu sırasında transfer pipetini dikkatli bir şekilde izlerken transfer pipetinin ucundaki küçük hava kabarcığını dikkatlice dışarı atın. Kültür ortamının merkezi kısmının dışarı atıldığı onaylandıktan sonra, prosedürü durdurun ve transfer pipetini yavaşça çıkarın.
   6. Yumurtalıkları, yumurta kanallarını ve uterusu karın boşluğuna geri yerleştirin. Kas tabakasını ve cildi ayrı ayrı dikin. Fareleri anesteziden kurtulana kadar bir ısıtma yastığına yerleştirin. Farelerin refahını sağlamak için, iyileşme döneminde fareleri yakından izleyin ve sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar onları gözetimsiz bırakmayın.
5. Hamileliğin gözlemlenmesi
   1. Ameliyattan sonra, doğan yavru sayısını izlemek için fareleri 18-21 gün boyunca gözlemleyin. Distosi (zor doğum) durumunda, sezaryen yapın. Yeni doğan farelerin aynı yaş grubundaki emziren barajlar tarafından beslenmesine izin verin.

3. Rastgele kan şekeri, açlık kan şekeri ve glikoz tolerans testi

1. Fare büyümesi sırasında rastgele kan şekeri seviyelerinin izlenmesi
   1. Farelerin doğumundan bu yana, iyi bir beslenme ve eğlence gecesinden sonra her 4 haftada bir sabah 9'da rastgele kan şekeri seviyesini izleyin.
      1. Kuyruk damarı kanı elde etmek için fare kuyruğu ucunu delin.
      2. İlk damla kan, beraberinde karışan doku sıvısının varlığı nedeniyle daha yüksek bir şeker ölçüm değerine sahiptir. Bu nedenle, temiz emici kağıt kullanarak ilk kan damlasını nazikçe silin.
      3. El tipi bir glukometre ile kuyruk damarından ikinci damladan (~ 4 μL) kan şekerini ölçün.
2. Fare gelişimi sırasında açlık kan şekeri ve glukoz toleransındaki değişikliklerin izlenmesi
   NOT: İlk kan örnekleme zaman noktasının 15 dakika olduğu göz önüne alındığında, tüm farelerin 15 dakika içinde enjekte edilmesi gerekir. Her fare enjeksiyonu 20-30 saniye sürdüğünden, enjeksiyonların bu zaman dilimi içinde tamamlanmasını sağlamak için her testte kullanılabilecek maksimum fare sayısı 30'u geçemez.
   1. Gece boyunca aç tutulan farelerde doğumdan sonra her 4 haftada bir açlık kan şekeri ve glikoz tolerans testlerini yapın.
      1. İlk gün taze ışınlanmış talaş, yatak takımları, temiz kafesler, kapaklar ve su şişeleri hazırlayın. Fareleri yiyeceksiz taze bir kafese aktarın. Kafeslere besleme etiketleri ekleyin.
      2. Yeterli% 10 glikoz enjeksiyonu (steril ve pirojen içermeyen) ve 1 mL şırınga hazırlayın.
      3. Her gruptaki farelerin 1. gün saat 17:00'den 2. gün saat 9:00'a kadar 16 saat oruç tuttuğundan emin olun, ancak suya serbest erişime izin verin. Bir glikoz ölçüm cihazı kullanarak 3.1.1.1-3.1.1.3 adımlarında açıklandığı gibi açlık kan şekeri seviyelerini ölçün.
   2. Hızlı tanımlamayı kolaylaştırmak için fareleri tartın ve kuyruklarını işaretleyin. 10 μL/g fare ağırlığına sahip glikoz şırıngaları hazırlayın.
   3. 30 s aralıklarla, farenin intraperitoneal boşluğuna 10 μL / g glikoz enjekte edin.
      NOT: Yanlış sıvı enjeksiyon hacmini önlemek için burada enjeksiyon tekniklerine özel dikkat gösterilmelidir. Operasyonun kilit noktaları aşağıdaki gibidir:
      1. Fareyi hareketsiz hale getirin ve kuyruğu bir elinizle tutun. Karın boşluğundaki organların başa doğru kayması ve yeterli enjeksiyon alanı bırakması için başı kalçalardan biraz daha aşağıda tutun.
      2. İğneyi orta hat ile kalça kemiği arasına yerleştirin, deriden 45 derecelik bir açıyla geçirin, ardından iğneyi cilt yüzeyine ~ 0,5 cm paralel olarak hizalarken karın boşluğunun daha derinlerine nazikçe yönlendirin.
         NOT: İç organların kazara delinip delinmediğini belirlemek için enjeksiyon sırasında herhangi bir dirence dikkat edin.
      3. Şırıngayı karın boşluğuna çıkarın.
      4. Enjeksiyonun başladığı zamanı kaydedin ve enjeksiyon hızını kontrol etmek için bir zamanlayıcı kullanın. Zamanlayıcıyı kullanırken zaman kaybetmemek için zamanlayıcıyı üç fare için 90 s'ye ayarlayın.
   4. Kan şekeri ölçümünü kuyruk damarından istenen aralıklarla alın (glikoz uygulamasından 0, glikoz uygulamasından 15, 30, 60, 90 ve 120 dakika sonra).
      NOT: Sonraki kan şekeri testi de her fare için 20-30 saniye sürmelidir.
   5. Deneyden sonra fareleri yiyecek ve su ile donatılmış ev kafeslerine geri koyun.

Sonuçlar

Laboratuvarımızda farelerde epididimal kaudal sperm ile ICSI kullanılarak %89.57 döllenme oranı ve %87.38 2 hücre oranı elde ettik. ET'yi takiben yavruların doğum oranı yaklaşık% 42.50'dir. Dikkat çekici bir şekilde, tüm döllenme oranları, 2 hücreli oranlar ve yavru doğum oranları, insan ART'sinde elde edilen seviyelerle karşılaştırılabilir ve farelerde insan ART tekniklerinin farklı aşamalarının kapsamlı bir simülasyonunu sağlar. Daha fazla ayrıntı

Tartışmalar

Bu çalışma, insan destekli üreme teknolojisini (ART) kapsamlı bir şekilde özetlemek ve ICSI'nin ET ile birlikte yavru gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için fare intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) ve embriyo transferi (ET) tekniklerini entegre etti. ICSI tekniğinin normal fare spermi ile uygulanmasında yüksek döllenme (%86.76) ve 2 hücre oranı (%88.48) elde edilmiştir. ET'yi takiben, yavru farelerin doğum oranı yaklaşık% 42.50 idi ve bu da teknik platform...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.25% avertin (2,2,2-tribromoethanol)	Nanjing Aibei	M2960	for anesthetization
Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile	BD	353001
Bacteriological Petri Dishes 50 x 9 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile	BD	351006
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc.
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Dissection Microscope	Olympus	SZX16	Use in mouse embryo transfer
Fluorinert Fc-770	SIGMA	F3556	Fluorinert FC-770 is a thermally stable fully fluorinated liquid with high dielectric strength and resistivity, used as operating fluid
handheld glucometer	Roche	AccuChek performa	Blood glucose measurement
HTF	Merck	MR-070-D	The EmbryoMax Human Tubal Fluid (HTF) (1x), liquid designed for use with Mouse IVF is available in a 50 mL format and has been optimized and validated for Embryo Culture.
Hydraulic Microinjector	Eppendorf	CellTram 4r Oil, 5196000030	For sperm injection
Inverted Microscope	Nikon	TI2-U	Micromanipulation observation host
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Micromanipulator	NARISHIGE	NTX-N4	Micromanipulation arm
mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications.
Needle Cutter	Nanjing Aibei	Sutter MF-800	Use for fabricating micromanipulation needles
Needle Puller	Nanjing Aibei	Sutter model p-100	Use for making micromanipulation needles
Piezo Drill Trip Mouce ICSI	Eppendorf	5195000.087	Application of ICSI injection needle.
Piezoelectric Micromanipulator (Membrane Breaker)	Eppendorf	Eppendorf PiezoXpert	Use of micro-pulses to break the zona pellucida and oolemma of the oocyte
Pneumatic Microinjector	Eppendorf	CellTram 4r Air, 5196000013	For fixing the oocyte
Ready-to-use Human Chorionic Gonadotropin (Hcg)	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection. 50 IU/mL
Ready-to-use Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG)	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent, intraperitoneal injection. 50 IU/mL
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Oocyte retrieval and observation of embryo development